Количественная оценка сомах ганглиозных клеток сетчатки после глазной гипертензии, вызванной прижиганием

Возьмем химически фиксированную сетчатку, изолированную от глаза крысы.

Глаз демонстрирует вызванное теплом повреждение лимбального сосудистого сплетения, сети кровеносных сосудов, окружающих роговицу.

Это повреждение блокирует дренаж жидкости, увеличивая внутриглазное давление (ВГД) и вызывая дегенерацию ганглиозных клеток сетчатки (RGC).

Обработайте сетчатку раствором для проникновения клеток и ядерных мембран.

Примените блокирующий раствор для предотвращения связывания неспецифических антител.

Удалите решение для блокировки.

Введите первичные антитела, которые нацелены на транскрипционный фактор, преимущественно экспрессируемый в RGC.

Промойте для удаления несвязанных антител.

Введите флуорофор-конъюгированные вторичные антитела, которые связываются с первичными антителами.

Промойте для удаления несвязанных антител.

Покрасьте ядра ДНК-связывающим красителем.

Промойте сетчатку и закрепите ее на предметном стекле с помощью подходящей среды для крепления.

Визуализируйте сетчатку под эпифлуоресцентным микроскопом.

Сниженная плотность клеток в поврежденном глазу по сравнению с контролем подтверждает дегенерацию RGC из-за повышенного IOP.

После изоляции сетчатки перенесите их в 24-луночный планшет для культуры, содержащий 1 миллилитр PBS, держа внутреннюю сетчатку обращенной вверх. Промывайте ткань 0,5% неионогенным поверхностно-активным веществом, разведенным в PBS. Затем инкубируйте ткань в блокирующем растворе в течение одного часа при комнатной температуре с легким встряхиванием. Во время инкубации приготовьте первичный раствор антитела BRM 3A и храните при температуре 4 градуса Цельсия.

После блокировки тканей инкубируйте сетчатку в 200 микролитрах первичного раствора антител при температуре 4 градуса Цельсия в течение 72 часов с легким встряхиванием. Далее промойте салфетку с помощью PBS. Инкубировать ткань в 200 микролитрах раствора вторичного антитела в течение двух часов при комнатной температуре, а затем с раствором ядерного контрокрашивания в течение 10 минут для окрашивания флуоресцентных ядер.

После трех промываний PBS перенесите сетчатку на предметное стекло микроскопа с помощью двух маленьких кистей, сохраняя стекловидную сторону вверх. Расположите дорсальный квадрант сетчатки вверх на предметном стекле микроскопа. Наконец, нанесите 200 микролитров защитной среды на стеклянную защитную крышку и поместите ее на плоскую сетчатку для микроскопического анализа. Под конфокальным эпифлуоресцентным микроскопом с использованием объектива с 40-кратным увеличением исследуйте плоские крепления, чтобы оценить ганглиозные клетки сетчатки.