Оценка уровней возбуждающих нейротрансмиттеров у крыс с хронической эпилепсией

Возьмем контрольную крысу и крысу, вызванную хронической эпилепсией, которым имплантировали направляющую канюлю и электрод электроэнцефалограммы, или ЭЭГ, в гиппокамп.

Индукция эпилепсии увеличивает высвобождение возбуждающих нейротрансмиттеров, вызывая приток ионов в постсинаптические клетки, что генерирует непрерывные возбуждающие потенциалы. Это приводит к синхронизированным всплескам электрической активности, называемым судорогами, которые регистрируются с помощью электрода.

Вставьте в канюлю зонд для микродиализа с полупроницаемой мембраной.

Привяжите крысу к клетке системы записи ЭЭГ.

Введите физиологический буфер в ткань мозга через входное отверстие зонда.

Убедитесь в отсутствии судорог и соберите внеклеточную жидкость через выходное отверстие зонда для оценки уровня нейротрансмиттеров.

Повышенный базальный уровень у крысы-эпилептика указывает на повышение, опосредованное эпилепсией.

Добавьте буфер с высоким содержанием калия и соберите образцы.

Повышенное содержание калия продлевает возбудимость нейронов, вызывая непрерывное высвобождение нейромедиаторов.

Временный всплеск уровня нейротрансмиттеров как у эпилептиков, так и у контрольных крыс указывает на высокий уровень, вызванный калием.

Начните с подготовки зондов для микродиализа к первому использованию в соответствии с инструкцией производителя и заполните их раствором Рингера. Затем отрежьте отрезки трубки FEP длиной 10 сантиметров и соедините их с входными и выходными канюлями зонда, используя адаптеры для трубок разных цветов. Убедитесь, что трубка соприкасается с адаптерами без мертвого пространства во всех соединениях.

Извлеките пустышку из направляющей с помощью пинцета, крепко удерживая голову животного. Вставьте зонд для микродиализа в направляющую канюлю и с помощью пластилина для дальнейшего укрепления канюли. Далее подключите животное к привязной системе записи ЭЭГ. Затем поместите животное в цилиндр из плексигласа и позвольте ему исследовать новую среду. Следите за движениями бодрствующей и свободно движущейся крысы.

Затем подсоедините входное отверстие зонда к шприцу объемом 2,5 миллилитра с помощью затупленной иглы 22 калибра, содержащей раствор Рингера, с помощью адаптеров для трубок. Протолкните один миллилитр раствора Рингера в зонд за 10 секунд, непрерывно нажимая на поршень шприца объемом 2,5 миллилитра. Проверьте, не появилась ли капля жидкости на выпускном отверстии, чтобы показать, что зонд готов к использованию. Наконец, наполните 2,5 миллилитровые шприцы, соединенные с трубкой FEP с помощью адаптеров трубок, раствором Рингера и установите их на инфузионный насос. Запустите насос со скоростью два микролитра в минуту и дайте ему поработать на ночь.

После проверки с помощью видеозаписи ЭЭГ отсутствия приступов в течение трех часов, предшествующих забору пробы, остановить насос, несущий трубку FEP, канюлированные шприцы, заполненные раствором Рингера. Установите еще один комплект шприцев объемом 2,5 миллилитров, соединенных с трубкой FEP с адаптерами трубок, заполненными модифицированным раствором Рингера, содержащим 100 миллимолярный раствор калия. Запустите насос со скоростью 2 микролитра в минуту и дайте ему поработать. Проверьте отсутствие пузырьков воздуха в системе и убедитесь, что трубка соприкасается с адаптерами без мертвых зон во всех соединениях.

Затем проверьте, не появилась ли капля жидкости на выпускном отверстии, чтобы показать, что зонд готов к использованию. Далее подсоедините трубки FEP шприцев, заполненных раствором Рингера, к входной канюле зонда у каждого животного и дождитесь появления капли жидкости на кончике выходного отверстия. Подсоедините выходное отверстие зонда к трубке FEP, что приводит к сбору в пробирку.

Вставьте трубку FEP в закрытую пробирку объемом 0,2 миллилитра с перфорированной крышкой. И следите за тем, чтобы трубка оставалась на месте, зафиксировав ее кусочком пластилина. После работы насоса со скоростью 2 микролитра в минуту в течение 60 минут без сбора образцов для балансировки, система собирает пять последовательных 30-минутных образцов диализата в исходных условиях. И хранить образцы на льду.

Через 10 минут переключите трубку со шприцев, содержащих 100 миллимолярный раствор калия Рингера, на обычный раствор Рингера и дайте насосу поработать. После сбора пятого постуравновешенного диализата собирайте 20 микролитровых фракций диализата каждые 10 минут в течение одного часа. Затем соберите еще три 30-минутных образца диализата и остановите насос. Наконец, храните образцы при температуре минус 80 градусов Цельсия после эксперимента до анализа ВЭЖХ.