Энциклопедия экспериментов JoVE
Нейронауки
0 просмотров • 2:34 мин. • April 28th, 2025
Возьмите камерный слайд с монослойной культурой микрососудистых эндотелиальных клеток мозга крысы, или RBMECs.
Клетки соединены плотными соединительными белками, связанными с актиновым цитоскелетом, имитирующим эндотелиальный слой гематоэнцефалического барьера.
Замените среду на среду без кислорода, не содержащую глюкозы, затем поместите предметное стекло в камеру гипоксии.
Отсутствие кислорода и глюкозы препятствует синтезу АТФ. Оставшаяся АТФ расщепляется на нуклеотидные производные.
Истощение АТФ препятствует работе кальциевых насосов, повышая внутриклеточный кальций, который активирует ферменты оксидоредуктазы.
Затем пополните запасы кислородной среды, затем поместите предметное стекло в кислородный инкубатор. Активированные оксидоредуктазы используют вновь введенный кислород для разложения производных нуклеотидов, образуя активные формы кислорода или АФК.
АФК нарушает взаимодействие между плотными белками и индуцирует сигнальные пути, которые ремоделируют актиновый цитоскелет в стрессовые волокна, ослабляя межклеточные взаимодействия.
Монослой с нарушенными межклеточными взаимодействиями готов к анализу.
При подготовке, настройке и калибровке системы культивирования клеток гипоксии в соответствии с инструкциями производителя. Среда камеры должна состоять на 95% из азота, на 5% из углекислого газа и при температуре 37 градусов Цельсия. Теперь деоксигенационируйте безглюкозный dmem, поместив его в камеру гипоксии на 4-6 часов. Позже начните подвергать клетки стрессу, заменив их среду на дезоксигенированную безглюкозную DMEM. А затем помещение клеток в камеру гипоксии на два часа. Через два часа поместите клетки обратно в полноценную среду эндотелиальных клеток мозга крысы. Затем повторно насытьте клетки кислородом, вернув их в нормальное состояние в течение часа.