Нативная хроматиновая иммунопреципитация клеток нейросферы

Возьмем клетки нейросферы в буфере, содержащем детергенты, кальций и ингибиторы протеазы.

Детергент проникает в клетки, в то время как ингибитор инактивирует протеазы, сохраняя связанный с хроматином целевой белок.

Добавьте нуклеазу и инкубируйте. Нуклеаза использует кальций для переваривания хроматина.

Добавьте ЭДТА-содержащий буфер, который хелатирует кальций, инактивируя нуклеазу.

Добавьте буфер для лизиса для лизиса клеток, высвобождая хроматин.

Центрифугируйте и соберите надосадочную жидкость.

Добавьте антитела, специфичные к белку-мишени, и инкубируйте с вращением. Центрифугируйте и удалите надосадочную жидкость.

Введите магнитные шарики, нацеленные на антитело, и инкубируйте с вращением.

Добавьте буфер для лизиса для отделения неспецифически связанной ДНК.

Магнитом захватите шарики и удалите надосадочную жидкость.

Добавьте буфер с высоким содержанием соли для отделения неспецифически связанных белков.

Магнитом захватите шарики и удалите надосадочную жидкость.

Добавьте буфер стабилизации, магнитно захватите шарики и удалите загрязнения.

Ресуспендируйте в буфере протеиназы-К для переваривания белков, высвобождая ДНК.

Как только нейросферы будут собраны, центрифугируйте 1 раз по 10 до 6 клеток нейросферы на иммунопреципитацию при 300 умножении g в течение 5 минут. После центрифугирования сцедите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу нейросферы в одном миллилитре сбалансированного раствора соли. Перенесите суспензию в микроцентрифужные пробирки с низким содержанием белка объемом 1,5 миллилитров, затем центрифугируйте, как и раньше.

Затем сцеживаем надосадочную жидкость и повторно суспендируем клеточную гранулу в 95 микролитрах буфера для пищеварения, дополненного 1 к 100 коктейлем ингибиторов протеазы из расчета 1 умножить на 10 на 6 клеток. Немедленно пипетируйте клетки вверх и вниз, чтобы предотвратить образование комков и образования пузырьков. Затем смешайте 5 микролитров 0,1x микрококковой нуклеазы и 145 микролитров буфера для пищеварения и добавьте 5 микролитров разбавленной микрококковой нуклеазы из расчета 1 умножить на 10 к 6 клеткам. Перемешайте трубку и поместите трубку в нагревательный блок при температуре 37 градусов Цельсия ровно на 12 минут.

Расщепление микрококковой нуклеазы до фрагмента хроматина является наиболее важным этапом. Правильная фрагментация хроматина важна для достижения высокого разрешения ChIP. Чтобы убедиться в успешности этого этапа, инкубируйте несколько образцов по одному, чтобы не допустить переваривания.

Через 12 минут добавьте 10 микролитров 10-кратного буфера для остановки микрококковой нуклеазы в 1 раз по 10 на 6 клеток. С этого момента образцы должны храниться на льду. Биоаналитический анализ образца микрококковой нуклеазы показывает, что большая часть ДНК была фрагментирована на моно-, ди- и трехнуклеосомы. Затем добавьте 110 микролитров 2x RIPA буфера, дополненного 1 к 100 коктейлем ингибиторов протеазы, из расчета 1 на 10 на 6 клеток.

Проведите пробиркой, чтобы перемешать, затем центрифугируйте в течение 15 минут при 4 градусах Цельсия и 1,700 g. Перенесите надосадочную жидкость, содержащую хроматин, в обычную микроцентрифугу объемом 1,5 миллилира и положите на лед. Используйте буфер RIPA с добавлением ингибиторов протеазы в концентрации от 1 до 1000 для разбавления хроматина так, чтобы каждый IP имел объем от 100 до 200 микролитров. Затем удалите аликвоту, эквивалентную 10% от объема ChIP, в качестве входной выборки.

Подготовьте вход, добавив 100 микролитров TE-буфера с добавлением протеиназы-К, и инкубируйте при температуре 55 градусов Цельсия в течение одного часа. После очистки входного сигнала с помощью набора для очистки ПЦР измерьте концентрацию входного сигнала с помощью микрообъемного спектрофотометра. Запишите результаты в блокнот. Добавьте 10 микролитров промытых белковых магнитных шариков A и G на каждый образец, который будет выполнен на каждом образце, и инкубируйте в течение одного часа при температуре 4 градуса Цельсия с вращением со скоростью 20 оборотов в минуту.

Поместите образец на магнитный держатель и дайте бусинам разойтись. Затем переложите необходимый объем в новые 1,5 миллилитровые пробирки. Добавьте нужное антитело в каждую пробирку, а затем оберните крышки пластиковой парафиновой пленкой, чтобы избежать испарения. Инкубируйте образцы в течение ночи при температуре 4 градуса Цельсия с вращением, как и раньше. На следующий день вращайте трубки со скоростью 2000 умноженных на g в течение 10 секунд. Затем добавьте по 10 микролитров шариков в каждый IP и выдерживайте в течение трех часов при температуре 4 градуса Цельсия с вращением со скоростью 20 оборотов в минуту.

Затем поместите образцы на магнитную подставку и дайте магнитным бусинам разойтись. С помощью пипетки удалите надосадочную жидкость. Затем добавьте 150 микролитров буфера RIPA с ингибиторами протеазы в каждый IP и инкубируйте при температуре 4 градуса Цельсия при 20 об/мин в течение 5 минут. После инкубационного периода поместите образцы на магнитную подставку и дайте магнитным шарикам разойтись. С помощью пипетки удалите надосадочную жидкость. Затем добавьте по 150 микролитров буфера хлорида лития, дополненного ингибиторами протеазы в низкой концентрации, в каждый IP и инкубируйте при температуре 4 градуса Цельсия с вращением при 20 об/мин в течение 5 минут.

После инкубационного периода поместите образцы на магнитную подставку и дайте магнитным бусинам разойтись. Затем с помощью пипетки удалите надосадочную жидкость. Затем добавьте в бусины 150 микролитров холодного TE без ингибиторов протеазы и инкубируйте при температуре 4 градуса Цельсия с вращением при 20 об/мин в течение 5 минут. После заключительной стадии промывки повторно суспендируйте образец в 100 микролитрах TE-буфера с конечной концентрацией 0,5 мг на миллилитр протеиназы-К и инкубируйте при температуре 55 градусов Цельсия в течение одного часа.