Проведение двойной флуоресцентной гибридизации in situ для выявления экспрессии генов в срезах мозга мыши

Возьмем химически фиксированный срез мозга мыши.

Добавьте гибридизационную смесь, содержащую агент пермеабилизации и зонды РНК, меченные FITC или DIG.

Инкубируйте для обеспечения проникновения клеток и проникновения зонда.

Зонды связываются с комплементарными последовательностями на мРНК MBP, референсном маркере, повсеместно экспрессируемом в олигодендроцитах, или мРНК ASPA, являющейся мишенью.

Промойте, чтобы удалить несвязанные щупы.

Добавьте блокирующий буфер для предотвращения связывания неспецифических антител.

Введение HRP-конъюгированных анти-FITC-антител, нацеленных на зонд, меченный FITC.

Помыть, затем добавить ФИТК-тирамид.

HRP окисляет FITC-тирамид до высокореакционноспособной формы, которая связывается с близлежащими белками, усиливая сигнал флуоресценции.

Промойте и снова введите блокирующий буфер.

Добавьте конъюгированные щелочную фосфатазу антитела против DIG, нацеленные на зонд, меченный DIG.

Вымойте и нанесите раствор Fast Red.

Щелочная фосфатаза дефосфорилирует Fast Red, образуя флуоресцентный осадок.

Визуализируйте под флуоресцентным микроскопом.

Колокализация сигналов Mbp и ASPA указывает на экспрессию ASPA в олигодендроцитах.

Разведите два зонда в буфере для гибридизации, предварительно нагретом до 65 градусов Цельсия, и хорошо перемешайте. Нанесите по 300 микролитров гибридизационной смеси на каждую горку и накройте запеченным в духовке покровным стеклом. Впоследствии инкубируйте предметные стекла в течение ночи при температуре 65 градусов Цельсия в увлажненной камере.

На следующий день переложите слайды в банку Coplin, содержащую предварительно подогретый буфер для стирки, и промойте слайды в течение 30 минут, дважды при температуре 65 градусов Цельсия. После этого вымойте слайды в течение 10 минут трижды раствором для стирки MABT комнатной температуры.

На этом этапе с помощью гидрофобной ручки нарисуйте круги вокруг участков ткани. Затем инкубируйте предметные стекла в течение одного часа при комнатной температуре с блокирующим буфером ISH в увлажненной камере. Затем инкубируйте предметные стекла в течение ночи при температуре 4 градуса Цельсия с антителом против FITC, конъюгированным с пероксидазой хрена.

Затем поместите предметные стекла в банку Coplin, содержащую PBST. Промойте их в PBST три раза по 10 минут каждый раз и каждый раз заменяйте свежим PBST. После этого добавьте флуоресцентный тирамид на предметные стекла и оставьте их на 10 минут при комнатной температуре. Поместите предметные стекла в банку Coplin и простирайте в PBST в течение 10 минут три раза.

Затем инкубируйте предметные стекла с блокирующим буфером ISH в течение одного часа при комнатной температуре. Затем инкубируйте предметные стекла в течение ночи при температуре 4 градуса Цельсия с помощью конъюгированного антитела против DIG с щелочной фосфатазой. После этого промойте их MABT три раза по 10 минут каждый раз. Далее дважды промойте предметные стекла 0,1 моляром Tris-HCL при pH 8,2 в течение пяти минут при комнатной температуре.

Отфильтруйте быстрый красный раствор и инкубируйте предметные стекла при температуре 37 градусов Цельсия с быстрым красным раствором во увлажненной камере. Поскольку время для оптимального развития варьируется, регулярно проверяйте предметные стекла с помощью флуоресцентного микроскопа, чтобы контролировать образование осадка. Затем промойте их три раза PBST в течение 10 минут каждый раз.