Проведение двойной флуоресцентной гибридизации in situ для выявления экспрессии генов в срезах мозга мыши

Возьмем химически фиксированный срез мозга мыши.

Добавьте гибридизационную смесь, содержащую агент пермеабилизации и зонды РНК, меченные FITC или DIG.

Инкубируйте для обеспечения проникновения клеток и проникновения зонда.

Зонды связываются с комплементарными последовательностями на мРНК MBP, референсном маркере, повсеместно экспрессируемом в олигодендроцитах, или мРНК ASPA, являющейся мишенью.

Промойте, чтобы удалить несвязанные щупы.

Добавьте блокирующий буфер для предотвращения связывания неспецифических антител.

Введение HRP-конъюгированных анти-FITC-антител, нацеленных на зонд, меченный FITC.

Помыть, затем добавить ФИТК-тирамид.

HRP окисляет FITC-тирамид до высокореакционноспособной формы, которая связывается с близлежащими белками, усиливая сигнал флуоресценции.

Промойте и снова введите блокирующий буфер.

Добавьте конъюгированные щелочную фосфатазу антитела против DIG, нацеленные на зонд, меченный DIG.

Вымойте и нанесите раствор Fast Red.

Щелочная фосфатаза дефосфорилирует Fast Red, образуя флуоресцентный осадок.

Визуализируйте под флуоресцентным микроскопом.

Колокализация сигналов Mbp и ASPA указывает на экспрессию ASPA в олигодендроцитах.

Разведите два зонда в буфере для гибридизации, пр