Иммунофлуоресцентное окрашивание инфицированной фиброваскулярной ткани пациента, полученной от геля
JoVE Encyclopedia of Experiments
Нейронауки
0 просмотров • 4:31 мин • April 28th, 2025
Принимайте регидратированную фибрин-гелевую, фиксированную и пермеабилизированную фиброваскулярную ткань, полученную от пациента. Эта ткань содержит неправильные неоваскулярные структуры с эндотелиальными клетками и перицитами.
Обработайте ткань блокирующим раствором, чтобы предотвратить связывание неспецифических антител.
Инкубируйте с первичными антителами, нацеленными на поверхностные белки на эндотелиальных клетках и перицитах.
Промойте буфером, чтобы удалить несвязанные антитела, затем инкубируйте в буфере.
После промывки буфера инкубируйте с флуоресцентными вторичными антителами, конъюгированными с красителем, для связывания с первичными антителами.
Промойте буфером, чтобы удалить излишки антител, и инкубируйте в буфере.
После промывки буфера добавьте ядерный краситель к окрашиванию ядер клеток. Промойте буфером и деионизированной водой, чтобы удалить несвязанный краситель.
Перенесите ткань на предметное стекло микроскопа.
Нанесите монтажный материал и уплотните его с помощью покровного стекла, содержащего быстрозатвердевающий монтажный материал.
После сушки на воздухе храните предметное стекло при низкой температуре. Затем визуализируйте ткань под эпифлуоресцентным микроскопом, чтобы визуализировать пространственное расположение эндотелиальных клеток и перицитов в неоваскулярных структурах.
Наклоните пластину на подставку и инкубируйте капли в 500 микролитрах блокирующего раствора в течение двух часов при комнатной температуре. Приготовьте первичную смесь антител согласно текстовому протоколу.
Затем используйте шпатель с закругленными краями, чтобы перенести капли на круглую 96-луночную пластину. Инкубируйте капли в 30 микролитрах первичной смеси антител на одну каплю в течение ночи при температуре 4 градуса Цельсия. На следующий день переложите капли в 12-луночную пластину, содержащую 2 миллилитра моющего раствора на лунку. Смойте капельки тремя 5-минутными стирками. Затем смойте капли девятью 30-минутными промывками.
На следующий день промойте капли три раза PBS. Приготовьте соответствующую смесь флуорофорных конъюгированных вторичных антител в соответствии с текстовым протоколом. Перенесите капли на 96-луночный планшет с круглым дном, как показано ранее. И инкубируйте тарелку с 30 микролитрами вторичной смеси антител в течение четырех часов при комнатной температуре, защищенной от света.
Через 4 часа переложите капли на 12-луночную пластину, содержащую 2 миллилитра моющего раствора на лунку. Сначала промойте капли тремя 5-минутными стирками. Затем смойте капли четырьмя 30-минутными промывками.
На следующий день промойте капли пять раз моющим раствором в течение 30 минут и три раза PBS в течение 30 минут. На следующий день перенесите капли на 96-луночный планшет с круглым дном, как показано ранее. Закрасьте капли ядерным красителем Hoechst в течение 30 минут при комнатной температуре. Перенесите капли в 12-луночный планшет, содержащий 2 миллилитра PBS на лунку. И трижды промыть PBS.
Затем нанесите узкий слой быстроупрочняющейся монтажной среды по краям квадратного защитного стекла. И дайте ему высохнуть в течение одной минуты. Затем промойте каплю, опустив ее в лунку 12-луночной пластины, содержащей деионизированную воду. И перенесите каплю на предметное стекло микроскопа.
Далее нанесите 15 микролитров незатвердевающей монтажной среды, предотвращающей выцветание, на каплю. Аккуратно расположите защитное стекло над каплей так, чтобы монтажная среда была обращена к предметному стеклу. И пусть устаканится.
Дайте слайдам высохнуть в течение двух часов при комнатной температуре и храните их при температуре 4 градуса Цельсия в течение ночи. Наконец, визуализируйте предметные стекла с помощью вертикального эпифлуоресцентного микроскопа, оснащенного функцией оптического среза с 20-кратным или 40-кратным объективом.
Обзор
В данной статье подробно описан протокол визуализации патологической фиброваскулярной ткани пациента с помощью флуоресцентной микроскопии. Метод предполагает использование специфических антител для визуализации эндотелиальных клеток и перицитов в неоваскулярных структурах.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Иммунофлуоресценция
Теоретическая часть
- Фиброваскулярная ткань играет важную роль при различных заболеваниях.
- Понимание клеточного состава неоваскулярных структур необходимо для разработки методов терапии.
- Флуоресцентная микроскопия позволяет детально визуализировать архитектуру ткани.
- Окрашивание антителами является ключевым методом идентификации специфических типов клеток.
Цель исследования
- Разработать надежный метод визуализации патологически измененной фиброваскулярной ткани.
- Визуализировать пространственное расположение эндотелиальных клеток и перицитов.
- Углубить понимание процессов неоваскуляризации при различных заболеваниях.
Используемые методы
- Подготовка образцов тканей, встроенных в регидратированный фибриновый гель.
- Блокирование неспецифического связывания антител с помощью блокирующего раствора.
- Инкубация с первичными и вторичными антителами для специфического окрашивания.
- Визуализация с использованием эпифлуоресцентного микроскопа.
Основные результаты
- Успешная визуализация эндотелиальных клеток и перицитов в образцах тканей.
- Демонстрация эффективности протокола окрашивания антителами.
- Получение детальных изображений неоваскулярных структур.
- Данный протокол служит основой для будущих исследований фиброваскулярной ткани.
Выводы
- Разработанный протокол визуализации эффективен для изучения патологически измененной фиброваскулярной ткани.
- Флуоресцентная микроскопия позволяет выявить важные клеточные взаимодействия.
- Данный метод может быть применен в дальнейших исследованиях в области биологии сосудов и связанных с ними заболеваний.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Данный протокол иммунофлуоресценции позволяет проводить детальное пространственное картирование эндотелиальных клеток и перицитов в фиброваскулярной ткани пациента, что способствует валидации мишеней при исследовании пролиферативной диабетической ретинопатии. Благодаря сохранению неоваскулярной архитектуры внутри фибринового геля, данный метод обеспечивает создание релевантной патологии системы для механистического снижения рисков при изучении ангиогенных путей. Такой подход повышает прогностическую достоверность выбора мишеней на доклиническом этапе за счет установления связи между молекулярными маркерами и структурной патологией.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем визуализации экспрессии белков в специфических типах клеток в поврежденных тканях.
- Практическая ценность: способствует снижению биологических рисков за счет прямого наблюдения за взаимодействиями сосудистых клеток в модели, производной от человеческих тканей.
- Прогностическая ценность: облегчает приоритизацию портфеля препаратов путем корреляции локализации биомаркеров с патологическими неоваскулярными структурами.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность к анализу: Подготовка валидированных биологических систем для последующего тестирования соединений путем стабилизации архитектуры тканей в геле.
- Количественный результат: Получение данных флуоресценции, позволяющих проводить стандартизированное сравнение экспрессии белков при различных условиях.
- Масштабируемость: Поддержка мультиплексного окрашивания в форматах многолуночных планшетов, что повышает пропускную способность кампаний по скринингу антител.
Трансляционные и доклинические исследования
- Клиническая значимость: Использование фиброваскулярной ткани, полученной от пациентов, для сохранения патофизиологической достоверности в доклинических моделях.
- Трансляционная преемственность: Обеспечение связи между результатами фундаментальных исследований и доклинической валидацией за счет сохранения контекста человеческих тканей.
- Принятие решений с учетом рисков: Определение критериев дальнейшего продвижения исследований путем выявления побочных эффектов в популяциях сосудистых клеток.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Данный метод вписывается в непрерывный процесс разработки — от идентификации мишени до оптимизации соединений-лидеров, обеспечивая валидацию на основе визуализации перед проведением функциональных анализов.
- Открывающая биология: поддерживает проверку гипотез путем сопоставления экспрессии белков с конкретными типами клеток в неоваскулярных очагах.
- Скрининг: обеспечивает готовность к анализу за счет воспроизводимой подготовки тканей и стандартизированных рабочих процессов окрашивания.
- Аналитика: предоставляет количественные измерения флуоресценции, позволяющие сравнивать степень взаимодействия с мишенью в различных экспериментальных группах.
- Трансляционные исследования: обеспечивает преемственность от наблюдений на тканях человека к механистическим исследованиям в модельных системах.
- Корпоративное повторное использование: создает многоразовую платформу визуализации для проектов по биологии сосудов в различных терапевтических областях.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает уверенность в валидации мишени за счет уменьшения механистической неоднозначности в моделях сосудистых заболеваний.
- Операционная ценность: обеспечивает воспроизводимость благодаря стандартизированным процедурам блокировки, промывки и и mounting-монтирования.
- Стратегическая ценность: улучшает принятие решений о целесообразности дальнейшего развития (go/no-go), обеспечивая прямую визуализацию взаимодействия с мишенью в патологической ткани.
- Влияние на портфель: позволяет осуществлять приоритизацию с учетом рисков путем установления связи между молекулярными данными и структурной патологией в образцах человеческого происхождения.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с методами иммунофлуоресценции и конфокальной/эпифлуоресцентной микроскопии.
- Зависит от валидации антител и инфраструктуры для детектирования флуоресценции.
- Необходима стандартизация между исследовательскими группами для обеспечения единообразия протоколов обработки тканей и окрашивания.
- Требует учета особенностей адаптации при применении к различным типам тканей или моделям заболеваний.
- Ограничено доступностью тканей и продолжительностью их жизнеспособности в условиях культуры ex vivo.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Ex Vivo роговицы орган культуры модель для заживления ран исследований
Похожие видео
0 Просмотры
Кислород-индуцированной ретинопатии Модель ишемической болезни сетчатки у грызунов
Похожие видео
0 Просмотры
Количественное измерение Invadopodia-опосредованного протеолиза внеклеточной матрицы в одно-и многоклеточных контексты
Похожие видео
0 Просмотры
Иммуноокрашивание клеток, инкапсулированных в 3D гидрогелевую систему
Похожие видео
0 Просмотры
Выявление организации цитоскелета инвазивных раковых клеток в 3D
Похожие видео
0 Просмотры
Наблюдение и количественная оценка Фибробластовой Фибрин Гель Компактион
Похожие видео
0 Просмотры
Долгосрочный Прижизненные Иммунофлуоресценции Визуализация тканей компонентов матрицы с эпифлуоресцентной и двухфотонного микроскопии
Похожие видео
0 Просмотры
Культура ткани модель Ex Vivo сортопопуляциях осложнений в пролиферативной диабетической ретинопатии
Похожие видео
0 Просмотры
Ориентация Альфа Синуклеин Агрегаты в кожных периферных нервных волокон по свободно плавающей иммунофлуоресценции Анализ
Похожие видео
0 Просмотры
Визуализация, количественная оценка и картирование популяций иммунных клеток в микроокружении опухолей
Похожие видео
0 Просмотры
Последнее обновление: 29 августа 2026