Иммуноокрашивание нейронов в срезах мозга мышей после флуоресцентной гибридизации in situ

Возьмите фиксированные и пермеабилизированные срезы мозга мыши, содержащие нейроны, включая холинергические нейроны, экспрессирующие холинацетилтрансферазу.

Срезы подвергаются флуоресцентной гибридизации in situ для обнаружения целевых мРНК, локализованных в холинергических аксонах, что приводит к усилению сигналов с помощью флуоресцентных зондов, которые обнаруживаются с помощью флуоресцентной микроскопии.

Добавьте блокирующий раствор, содержащий белки и гасящий агент. Белки предотвращают неспецифическое связывание, а закалочный агент нейтрализует остаточные фиксаторы.

Инкубируйте с первичными антителами, нацеленными на нейрональную холин-ацетилтрансферазу.

Промойте буфером, чтобы удалить несвязанные антитела.

Инкубируйте с фторофор-конъюгированными вторичными антителами, которые связываются с первичными антителами, связанными с холин-ацетилтрансферазой.

Промойте буфером, чтобы удалить излишки антител, затем промойте в дистиллированной воде, чтобы удалить остатки буфера.

Смонтируйте срезы с помощью монтажной среды, содержащей ядерное пятно, чтобы пометить ядра.

Используя флуоресцентную микроскопию, визуализируйте срезы, чтобы визуализировать целевые сигналы мРНК и холинергические аксоны, окрашенные специфическими антителами.

Налейте на каждый ломтик от 100 до 200 микролитров блокирующего раствора, содержащего три миллиграмма на миллилитр BSA, 100 миллимолярного глицина и 0,25% Triton X-100 в PBS. Накройте каждое предметное стекло парапленкой, и выдержите в течение 30 минут при комнатной температуре.

После инкубации в дозе от 100 до 200 микролитров антитела, разведенного в блокирующем растворе до предметных стекол, здесь используют антитело против холинацетилтрансферазы. После накрытия, горки с парапленкой, выдерживают в течение двух суток при четырех градусах Цельсия. Следите за тем, чтобы срезы мозга не пересыхали. При необходимости повторно нанесите раствор антитела против CHAT на срезы мозга через 24 часа после инкубации.

После трехкратной промывки предметных стекол в 1X PBS в течение пяти минут при комнатной температуре добавьте от 100 до 200 микролитров соответствующего конъюгированного вторичного антитела Alexa в предметные стекла. Накройте парапленкой и выдерживайте в течение часа при комнатной температуре в защищенном от света месте.

По истечении часа промойте предметные стекла три раза в 1X PBS в течение пяти минут каждый, как и раньше, а затем промойте один раз дистиллированной водой. Установите слайды с помощью монтажного носителя, содержащего DAPI. А затем визуализируйте срезы мозга под флуоресцентным микроскопом.