Клеточная Кальций Пробирной для средних и высокопроизводительного скрининга из ГТО Функции канала с помощью FlexStation 3
17 августа 2011 г.
Это видео содержит подробный протокол для изучения фармакологического профиля человека TRPA1 каналов с использованием FlexStation 3. Протокол охватывает детали клеточного подготовки, краситель загрузки и эксплуатации микропланшетов читателя, FlexStation 3.
Общая цель данной процедуры — продемонстрировать применение системы Flex Station 3 для изучения фармакологического профиля каналов транзиторного рецептора потенциала или TRPA1. Это достигается путем предварительной подготовки клеток, экспрессирующих каналы TRPA1, в 96-луночных микротитрационных планшетах.
После промывки клеток в мойке микропланшетов клетки нагружают кальций-чувствительным флуоресцентным красителем Fluo-4. После периода нагрузки клеток следует несколько дополнительных промывок. Следующим этапом процедуры является подготовка планшета с соединениями, включая триптофановый агонист и предполагаемый триптофановый антагонист.
В качестве заключительного этапа настраиваются параметры программного обеспечения для считывания планшета в системе Flex Station three. В конечном итоге можно получить результаты, демонстрирующие зависимости «доза-ответ» для активации trip A one флуфонеминовой кислотой и ее ингибирования антагонистом соединением A. Хотя данный метод позволяет изучить механизмы активации 21 путем измерения притока ионов кальция, он также может быть применен для изучения функций других проницаемых для кальция ионных каналов и белков, сопряженных с G-белком, с использованием кальций-чувствительных флуоресцентных красителей или красителей мембранного потенциала.
Основным преимуществом данного метода по сравнению с существующими подходами, такими как кальциевый имиджинг и ручное картирование с помощью патч-клампа, является то, что эта экспресс-техника обеспечивает высокопроизводительный скрининг функций и модуляции кальциевых каналов, железных каналов и других рецепторов, мобилизующих Ca. Перед началом данного протокола вырастите клетки HEK 293, стабильно трансфицированные trip A one, до плотности 70–90%, как описано в письменном протоколе. Чтобы начать подготовку клеток для анализа содержания кальция, покройте 96-луночные планшеты, внеся пипеткой 50 µL поли-L-орнитина в каждую лунку; инкубируйте планшеты при 37 °C не менее 15 минут.
После инкубации один раз промойте клетки фосфатно-солевым буфером KO. После обработки трипсином перенесите необходимое количество клеток HEC 2 93 в стерильную коническую пробирку объемом 15 миллилитров и центрифугируйте образец. Удалите супернатант и ресуспендируйте полученный осадок клеток.
В культуральную среду DMEM, дополненную 10% термоинактивированной эмбриональной телячьей сыворотки, внесите по 100 µL клеточной суспензии в каждую лунку планшета на 96 лунок. С помощью многоканального дозатора распределите суспензию, после чего оставьте планшет в вытяжном шкафу минимум на 30 минут, прежде чем поместить его в увлажненный инкубатор для культур клеток на период от 20 до 44 часов. Для подготовки к анализу на содержание кальция сначала приготовьте растворы, как описано в письменном протоколе.
После приготовления смешайте 10 µL 1 mM flu oh 4:00 AM с 10 µL onic. F1 27, затем перенесите все содержимое в 5 mL буфера для анализа flu oh four, содержащего 0,1% бычьего сывороточного альбумина.
Затем дважды промойте клетки, выращенные в 96-луночных планшетах, раствором HBSS по 80 µL на лунку с помощью мойки для микропланшаков. После промывки добавьте раствор для загрузки Fluo-4 в объеме 50 µL на лунку с помощью многоканального дозатора и инкубируйте планшет при 37 °C в течение одного часа. Во время часовой загрузки клеток подготовьте серию 3x растворов агонистов, серию 3x растворов антагониста и большой объем 300 µM агониста в буфере для анализа Fluo-4.
Перенесите по 300 µL разведенных растворов соединений в 96-луночный планшет для соединений. По возможности располагайте серийные разведения соединения, а также соответствующие положительный и отрицательный контроли в одном столбце планшета. Поскольку станция Flex station three считывает по одному столбцу за раз, на заключительном этапе подготовки клеток донесите по 300 µL раствора агониста с концентрацией 300 µM в лунки, соседние с каждой лункой, содержащей антагонист.
Трижды промойте загруженные клетки буфером Fluohore 4 с использованием мойщика микропланшетов, оставив после последнего промывания 80 µL буфера Fluohore 4 в каждой лунке. Для начала считывания планшета включите систему FlexStation 3 и запустите программное обеспечение SoftMax Pro 5.2.
Сохраните эксперимент под новым именем файла в настройках. Выберите гибкий режим (flex mode) и введите параметры для измерения эффектов агониста и антагониста, как указано в письменном протоколе. Затем поместите новый блок с наконечниками, планшет с соединениями и планшет для считывания в соответствующие лотки станции flex. Три.
Запустите считывание планшета, нажав кнопку read в программном обеспечении Soft Max Pro. Система Flex Station three будет считывать данные по одному столбцу и добавлять соединения в заранее заданные моменты времени, не прерывая процесс считывания. После завершения анализа экспериментальные данные можно обработать непосредственно в программе Soft Max PRO или скопировать и вставить в любую программу для работы с электронными таблицами, например, Microsoft Excel.
Для анализа данных постройте кривые «концентрация-эффект» для агониста флуфонемиковой кислоты и для предполагаемого соединения-антагониста, используя метод наименьших квадратов, как описано в письменном протоколе. TRP1 представляет собой проницаемый для кальция катионный канал, активация которого приводит к притоку кальция, который может быть зафиксирован с помощью чувствительного к кальцию красителя Fluo-4 AM. На рисунке представлены репрезентативные трассы временного хода изменений флуоресценции в ответ на серию концентраций флуфонемиковой кислоты (FFA). При более высоких концентрациях FFA вызванное увеличение флуоресценции характеризуется гораздо более быстрой кинетикой, чем при низких концентрациях, несмотря на схожие уровни пиковой флуоресценции.
Для выявления этих различий была построена кривая зависимости отклика от концентрации путем измерения начальных скоростей увеличения флуоресценции. При добавлении различных концентраций FFA полумаксимальная эффективная концентрация FFA составила 55,4 micromolar. Также представлена кривая зависимости отклика от концентрации при ингибировании вызванного FFA кальциевого ответа предполагаемым антагонистом TRP1 — соединением A.
Доза независимо снижала ответ клеток trip A one на FFA с полумаксимальной ингибирующей концентрацией 4,3 micromolar. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как изучать фармакологические профили triple A one и родственных каналов с использованием flag station three.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном видео демонстрируется протокол исследования фармакологического профиля каналов TRPA1 человека с использованием системы FlexStation 3. Процедура включает подготовку клеток, введение красителя и работу с микропланшетным ридером.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Фармакология
- Клеточная биология
- Электрофизиология
Теоретические сведения
- Каналы TRPA1 играют важную роль в сенсорной трансдукции.
- Понимание их фармакологического профиля может помочь в разработке лекарственных препаратов.
- FlexStation 3 представляет собой универсальный инструмент для высокопроизводительного скрининга.
- Для измерения активности каналов используются кальций-чувствительные красители.
Цель исследования
- Предоставить подробный протокол для изучения каналов TRPA1.
- Продемонстрировать использование системы FlexStation 3 в фармакологических исследованиях.
- Способствовать пониманию механизмов модуляции каналов TRPA1.
Используемые методы
- Подготовка клеток, экспрессирующих каналы TRPA1, в микропланшетах.
- Промывка клеток с помощью автоматического промывателя микропланшетов.
- Загрузка в клетки кальций-чувствительного флуоресцентного красителя (Fluo-4 AM).
- Подготовка планшетов с соединениями — агонистами и антагонистами TRPA1.
Основные результаты
- Успешная загрузка клеток флуоресцентным красителем.
- Эффективное использование системы FlexStation 3 для измерения активности TRPA1.
- Идентификация модуляторов TRPA1 с помощью фармакологического профилирования.
- Демонстрация применимости данного протокола в исследованиях.
Выводы
- Данный протокол представляет собой надежный метод изучения каналов TRPA1.
- FlexStation 3 является эффективным инструментом для фармакологических исследований.
- Понимание механизмов модуляции TRPA1 может привести к достижениям в области терапии.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Данный протокол позволяет проводить фармакологическое профилирование каналов TRP со средней и высокой пропускной способностью с помощью измерения потока ионов кальция, что способствует валидации мишеней на ранних этапах и снижению механистических рисков. Количественная оценка активности агонистов и ингибирующего действия антагонистов в воспроизводимом автоматизированном формате обеспечивает прогностическую уверенность при приоритизации модуляторов ионных каналов в рамках процессов поиска новых лекарственных соединений. Такой подход снижает зависимость от низкопроизводительных методов электрофизиологии, ускоряя переход от стадии поиска хитов к оптимизации лидеров для сенсорных и патофизиологических мишеней.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичное обнаружение и валидация мишени
- Научная ценность: Исследование функции канала TRPA1 посредством дозозависимого притока ионов кальция, что позволяет механистически подтвердить взаимодействие с мишенью.
- Практическая ценность: Использование клеток HEK293, экспрессирующих человеческий TRPA1, для создания транслябельной модели гиперэкспрессии с целью фармакологического анализа.
- Прогностическая ценность: Определение значений EC50 и IC50 (55.4 µM и 4.3 µM соответственно) для поддержки анализа зависимости «структура — активность» на ранних этапах идентификации ведущих соединений.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: обеспечивает количественные показатели флуоресценции в режиме реального времени с помощью Fluo-4 AM, что позволяет оценивать Z'-фактор и воспроизводимость анализа.
- Совместимость с пропускной способностью: использует функцию поколоночного считывания системы FlexStation 3 с автоматизированным переносом жидкости для скрининга в 96-луночном формате.
- Совместимость реагентов: демонстрирует использование кальций-чувствительных красителей и многоканального дозирования для обеспечения единообразного нанесения красителя и подачи соединений.
Трансляционные и доклинические исследования
- Значимость для медицины: Роль TRPA1 в ноцицепции обосновывает его использование в качестве механистического индикатора модуляции путей передачи боли при доклиническом скрининге безопасности и эффективности.
- Трансляционная преемственность: Обеспечивает согласованность данных между различными форматами — от моделей с гиперэкспрессией до валидации на нативных тканях — с использованием одного и того же принципа считывания потока ионов.
- Снижение рисков: Позволяет уменьшить количество ложноположительных результатов путем подтверждения потока кальция как функционального показателя перед переходом к использованию метода локальной фиксации потенциала (patch-clamp) или моделей in vivo.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод вписывается в рабочий процесс поиска лекарственных средств — от валидации мишени до оптимизации ведущих соединений, обеспечивая масштабируемый промежуточный этап между подтверждением гиперэкспрессии и вторичной электрофизиологической валидацией.
- Открывательная биология: позволяет проверить гипотезы о модуляции TRP-каналов, используя поток ионов кальция в качестве прямого функционального показателя активации каналов.
- Скрининг: обеспечивает стандартизацию и воспроизводимость анализа за счет автоматизированного добавления реагентов и кинетического считывания в режиме Flex.
- Аналитика: позволяет строить кривые зависимости «концентрация — ответ» на основе начальной скорости реакции, что дает возможность кинетически дифференцировать эффективность агонистов помимо амплитуды пика.
- Трансляционные исследования: связывают данный метод с доклиническими работами путем установления консервативного показателя (потока кальция), применимого в различных модельных системах.
- Корпоративное повторное использование: создает универсальную платформу для скрининга других проницаемых для Ca2+ каналов (например, TRPV1, TRPM8) и GPCR с использованием того же красителя и конфигурации ридера.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: позволяет снизить механистические риски, подтверждая модуляцию мишени с помощью прямого количественно определяемого вторичного посредника (Ca2+).
- Практическая ценность: обеспечивает стандартизацию, воспроизводимость и масштабируемость за счет автоматизированного считывания планшетов и кинетического анализа.
- Стратегическая ценность: оптимизирует принятие решений о продолжении или прекращении разработки («go/no-go») за счет создания ранних фармакологических профилей с определенными порогами эффективности.
- Влияние на портфель: позволяет проводить приоритезацию модуляторов ионных каналов с учетом рисков, основываясь на функциональной эффективности и селективности.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с культурами клеток, транзиентной/стабильной трансфекцией и флуоресцентными красителями.
- Необходим прибор FlexStation 3 с режимом FLEX, программное обеспечение SoftMax Pro и мойка микропланшетов для автоматизированной работы с жидкостями.
- Для получения согласованных результатов требуется межкомандная стандартизация протоколов загрузки красителя и формата планшетов с соединениями.
- Адаптация метода для нативных или первичных клеток может потребовать оптимизации уровней экспрессии и фоновой флуоресценции.
- Метод ограничен флуоресцентными методами считывания; он несовместим с красителями, склонными к тушению, или соединениями, которые влияют на возбуждение/эмиссию Fluo-4 AM.
