Визуализация рецепторов нейротрансмиттеров в синапсах сетчатки с высоким разрешением

Сделайте срез сетчатки мыши на сетке электронной микроскопии. Секция содержит ганглиозные клетки сетчатки, или РГК, синаптически связанные с биполярными клетками.

Пресинаптические биполярные клетки содержат нейротрансмиттные везикулы, расположенные в виде ленты вблизи синаптической мембраны.

Постсинаптические РГК отображают на своей мембране кластерные нейротрансмиттеры. Эти клетки помечены субъединицей холерного токсина B или CTB.

Промойте буфером для поддержания pH.

Инкубируйте с блокирующим буфером для маскировки неспецифических сайтов связывания.

Инкубируйте с первичными антителами, нацеленными на рецепторы нейротрансмиттеров и СТБ.

Промойте буфером, чтобы удалить несвязанные антитела и поддерживать pH.

Инкубируйте с вторичными антителами, конъюгированными с наночастицами золота разного размера, которые связываются с первичными антителами, мечая молекулы-мишени.

Удалите несвязанные антитела, затем высушите образец на воздухе.

Нанесите тяжелые металлы, которые связывают макромолекулы, усиливая контраст.

С помощью электронной микроскопии можно идентифицировать РГК с помощью меченых НТБ и найти меченые рецепторы нейротрансмиттеров.

На этом этапе ультратонкие срезы толщиной 70 нанометров с помощью ультрамикротома и соберите их на никелевых сетках с углеродным покрытием Formvar. Промойте решетки в дистиллированной воде один раз, а затем три промывки TBS. Затем инкубируйте сетки в 20 микролитрах 5% БСА в TBS в течение 30 минут, а затем в 20 микролитрах смеси, содержащей козий анти-CTB и антитело к одной субъединице NMDAR, в течение ночи при комнатной температуре.

После этого промойте сетки три раза 20 микролитрами TBS каждый раз при pH 7.6. Впоследствии один раз промойте сетки TBS при pH 8,2 в течение пяти минут. Инкубируйте сетки в течение двух часов с 20 микролитрами смеси, содержащей IgG против кролика осла, соединенного с частицами золота длиной 10 нанометров, и IgG против козы оленка, соединенного с частицами золота размером 18 нанометров.

Через два часа промойте сетки в 20 микролитрах TBS при pH 7.6 три раза, а затем промойте в ультрачистой воде. А затем просушите сетки на воздухе. Затем в течение восьми минут в дистиллированной воде добавляйте 5% уранилацетата, а затем 0,3% цитрата свинца в дистиллированную воду в течение пяти минут в темноте.