Мониторинг активации рецепторов запаха в рекомбинантных клетках в режиме реального времени

Начните с многолуночной пластины, содержащей адгезивные рекомбинантные клетки млекопитающих в растворе для стимуляции, дополненном люциферином, люминесцентным субстратом.

Incubate, чтобы разрешить проникновение люциферина в клетку.

Эти клетки экспрессируют мембранно-связанные рецепторы запаха в сочетании с обонятельными G-белками и рецепторно-транспортными белками.

Кроме того, клетки экспрессируют цитоплазматические белки Glosensor, люминесцентные белки, чувствительные к циклическому АМФ.

Инициируйте измерение люминесценции.

Молекулы запаха связываются с рецепторами запаха клеток, активируя связанный G-белок и диссоциируя α субъединицу G-белка, или Gα.

Диссоциированная субъединица Gα связывается с ферментом аденилатциклазы, встроенным в мембрану, активируя его. Активированный фермент преобразует АТФ в циклические АМП.

Эти циклические АМФ связываются с глосенсорными белками, изменяя их конформацию и обеспечивая связывание люциферина.

Это взаимодействие вызывает люминесценцию, подтверждающую активацию рецепторов запаха.

Добавьте 75 микролитров раствора реагента цАМФ. Раствор для интенсификации удалите из лунок и добавьте в каждую лунку по 25 микролитров разбавленного раствора реагента цАМФ. Инкубируйте 96-луночный планшет при комнатной температуре в темноте и без запаха в течение двух часов.

Сначала разведите одорант ацетофенон до 1% в 10 миллилитрах минерального масла и закупорьте тюбик. До окончания времени инкубации реагента цАМФ добавьте по 25 микролитров раствора одоранта в каждую лунку в новую 96-луночную пластину. Затем поместите эту одорантную пластину в камеру люминометра на пять минут, чтобы уравновесить камеру летучими молекулами одоранта. Настройте люминометр на запись люминесценции с нулевой задержкой в течение 20 циклов измерения пластины по 90 секунд с интервалом 0,7 секунды между циклами.

Непосредственно перед считыванием показаний планшета извлеките пластину с одорантом из камеры. В 96-луночную пластину, содержащую трансфицированные клетки, добавьте 25 микролитров одоранта в пространство между лунками и быстро поместите пластину обратно в камеру. Начните измерение люминесценции всех лунок на 20 циклов в течение 30 минут.