$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Возьмем мышь под наркозом с черепным окном с тонким слоем черепа, чтобы обеспечить визуализацию мозга с минимальной инвазивностью.
Под микроскопом определите артерию по кровотоку от крупных к мелким сосудам.
Введите светочувствительный краситель в хвостовую вену, которая через кровообращение попадает в мозг.
Возбуждайте краситель светом, чтобы он излучал флуоресценцию, что позволяет контролировать кровоток.
Увеличьте интенсивность света, чтобы вызвать образование тромбов, известное как фототромбоз.
Краситель поглощает свет высокой интенсивности, вступает в реакцию с кислородом и генерирует активные формы кислорода, которые повреждают эндотелиальные клетки.
Поврежденные клетки выделяют медиаторы, которые вызывают прилипание тромбоцитов, инициируя образование тромбов. Фибрин в крови помогает захватывать дополнительные клетки крови, создавая сгусток.
Сгусток, обнаруженный по накоплению красителя перед ним, препятствует притоку крови к мозгу.
Закройте разрез, нанесите антибиотики для предотвращения инфекции и введите анальгетики, чтобы уменьшить боль и обеспечить восстановление.
После того, как мышь будет установлена под микроскопом, приготовьте свежую бенгальскую розу в искусственной спинномозговой жидкости в дозе 20 миллиграмм на миллилитр. Фильтруйте, простерилизуйте смесь и утилизируйте ее после завершения эксперимента. Его нужно всегда употреблять в свежем виде.
Теперь, сканируя краниальное окно с помощью 561-нанометрового лазера, введите 0,1 смеси через хвостовую вену. В течение 5 секунд краситель должен быть легко заметен в черепной сосудистой сети. После того, как будет введено достаточное количество красителя, выберите сосуд размером от 40 до 80 микрон для тромбоза. Артерии можно дифференцировать от вен на основе потока крупных сосудов к меньшим, и наоборот.
Теперь подготовьтесь к лазерной обработке выбранного сосуда. Увеличьте время выдержки до уровня, подходящего для используемой системы. Увеличьте мощность лазера до 100% и установите коллекцию изображений на один кадр в секунду с максимальной скоростью сканирования. Сканируйте мышь до образования скрепки. Обычно на это уходит около пяти минут. В идеале для создания тромба должно быть отсканировано только одно поле зрения. Выберите цель в соответствии с этим. Если сгусток не образуется, попробуйте использовать больше красителя.
Как только сгусток сформируется, удалите мышь из области визуализации и подготовьтесь к завершению операции под препарирующим микроскопом. Во-первых, осторожно снимите кольцо, проверяя на наличие кровотечения. При возникновении кровотечения эксперимент должен быть прекращен.
Далее, с помощью шва 6-0, закройте разрез. Затем нанесите антибиотик на линию разреза. Для облегчения боли предусматривают подкожные инъекции бупренекса в течение трех дней. После введения первой инъекции бупренекса поместите мышь в операционную камеру и наблюдайте за ней до тех пор, пока она не станет амбулаторной. Затем верните его в домашнюю клетку, которую следует убрать. Продольная визуализация подробно описана в текстовом протоколе.