Оценка целостности гематоэнцефалического барьера на модели крысы с лазерно-индуцированным повреждением головного мозга

Возьмем контрольную крысу под наркозом и модель крысы с лазерной травмой мозга.

Применение лазера на правом полушарии повреждает клетки и гематоэнцефалический барьер, или ГЭБ, который отделяет кровь от мозговой ткани.

Введите отслеживающий краситель в канюлированную хвостовую вену, которая проходит через системный кровоток и достигает мозга.

Краситель связывается с белками плазмы и проникает в ткани мозга через поврежденный ГЭБ.

Усыпьте крыс.

Проведите крыс через сердце, чтобы удалить краситель из циркуляции.

Извлеките и разрежьте мозг, изолируйте срезы от поврежденного полушария и гомогенизируйте их.

Обработайте кислотным раствором, чтобы денатурировать белки, высвобождая краситель, связанный с белками.

Центрифугируйте и изолируйте надосадочную жидкость, содержащую краситель. Добавьте спирт для усиления флуоресценции красителя.

Перенесите раствор на микропланшет. При возбуждении более высокая интенсивность флуоресценции в поврежденном мозге указывает на повреждение ГЭБ, вызванное лазером.

Чтобы оценить частоту разрыва гематоэнцефалического барьера, через 24 часа после лазерной травмы загрузите в шприц 2% синий краситель Эванса, разведенный в 4 миллилитрах на килограмм физиологического раствора, и введите раствор внутривенно пострадавшим и контрольным крысам через канюлированную хвостовую вену.

Дайте раствору циркулировать в течение одного часа, прежде чем с помощью наборов хирургических булавок и ножниц открыть грудную клетку первого животного. Перфузируют обнаженное сердце охлажденным 0,9% физиологическим раствором через левый желудочек при давлении 110 миллиметров ртутного столба до тех пор, пока из правого предсердия не будет наблюдаться бесцветная перфузионная жидкость.

Далее собирают мозг, и получают 2-миллиметровые рострокаудальные срезы. Отделите срезы левого и правого полушарий, чтобы можно было отдельно оценить поврежденные и неповрежденные полушария, и взвесьте образцы. Гомогенизируйте образцы с помощью ступки и пестика и инкубируйте образцы тканей в 50% трихлоруксусной кислоте в течение 24 часов.

На следующий день центрифугировали гомогенизированные образцы тканей мозга в течение 20 минут при 10 000 g и комнатной температуре. Смешайте 1 миллилитр надосадочной жидкости с 1,5 миллилитрами 96% этанола в соотношении 1 к 3. Затем используйте флуоресцентный детектор с возбуждением 620 нм и длиной волны излучения 680 нм для оценки разрыва гематоэнцефалического барьера.