Флуоресцентная локализация белков плотного соединения и стрессовых волокон в эндотелиальных клетках

Возьмите камерный слайд, содержащий монослойную культуру микрососудистых эндотелиальных клеток мозга крысы, или RBMECs, имитирующую слой эндотелиальных клеток гематоэнцефалического барьера.

Клетки демонстрируют разрушенные плотные соединения белков и волокна актинового стресса из-за стресса от кислородно-глюкозного голодания с последующей реоксигенацией.

Удалите среду и промойте клетки, нанесите фиксатор для сохранения архитектуры клеток, затем смойте излишки фиксатора.

Обработайте моющим средством для проникновения клеточных мембран.

Инкубируйте с блокирующим агентом для маскировки неспецифических сайтов связывания.

Чтобы пометить белки с плотным соединением, инкубируйте с определенными первичными антителами, затем удалите несвязанные антитела.

Инкубируйте с флуорофор-конъюгированными вторичными антителами, чтобы пометить первичные антитела.

В качестве альтернативы, чтобы пометить стрессовые волокна, добавьте фаллоидин, меченный флуорофорами.

Wash для удаления несвязанных маркирующих молекул.

Снимите камеру, нанесите на ядра красителя, содержащую флуоресцентный ДНК-связывающий краситель, затем запечатайте покровным стеклом.

Используя конфокальную микроскопию, визуализируйте флуоресцентно помеченные плотные соединительные белки и стрессовые волокна.

Начните с воздействия на каждую лунку монослоев RBMEC со 100-200 микролитрами восстановленных сывороточных сред Opti-MEM и продолжайте их инкубацию в течение часа. Затем промойте камеру горками три раза, используя от 100 до 200 микролитров PBS на лунку на одну промывку. Закрепите клетки 4% параформальдегидом в PBS, и инкубируйте предметные стекла в течение 15 минут при комнатной температуре. И трижды промыть клетки PBS как и раньше.

Теперь проникните клетки, внося от 100 до 200 микролитров 0,5% Triton X-100 в PBS в каждую лунку. И дайте тарелке поинкубироваться еще 15 минут при комнатной температуре. После того, как клетки будут пропитаны, нанесите блокирующий раствор. И пусть это подействует на клетки в течение часа при комнатной температуре.

Затем либо проведите иммунофлюоресценцию для белка ZO-1, либо пометьте F-актин. Чтобы провести иммунофлюоресценцию клеток на ZO-1, инкубируйте их с первичным антителом в течение ночи при температуре 4 градуса Цельсия. На следующий день трижды промойте клетки в PBS, например, при снятии фиксатора. Затем инкубируйте клетки в 100-200 микролитрах вторичного антитела FITC tag против кролика в течение часа при комнатной температуре, чтобы пометить клетки родаминовым фаллоидином.

После применения блокирующего раствора в течение часа подвергайте клетки воздействию от 100 до 200 микролитров родамина фаллоидина в разведении от 1 до 50, с 2% BSA PBS в течение 20 минут. После инкубации вторичного антитела или родаминового фаллоидина промойте клетки PBS еще раз трижды, как и раньше. Затем снимите камеры, отклеив резинку. Приступайте к монтажу стекол, используя среду, содержащую антифейд и DAPI. Визуализируйте клетки с помощью конфокальной микроскопии в одной плоскости с 60-кратным объективом.