Иммуногистохимическое окрашивание биомаркеров в нейросферных срезах опухоли головного мозга

Возьми слайд со встроенными в парафин участками нейросфер опухолей мозга, кластерами нейральных стволовых клеток, демонстрирующих специфичные для опухоли ядерные белковые биомаркеры.

Нагрейте до расплавления парафина, удалите его с помощью ксилола и регидратируйте ткань с помощью уменьшающейся концентрации алкоголя.

Нагрейте в кислотном буфере, содержащем моющее средство, чтобы выявить эпитопы на биомаркерах и проникнуть в клеточные мембраны.

Промойте, затем обработайте окислителем, чтобы инактивировать эндогенные ферменты пероксидазы, предотвращая неспецифические сигналы.

Примените блокирующее решение для маскировки неспецифических сайтов привязки.

Инкубируйте с первичными антителами, нацеленными на эпитопы биомаркеров.

Промойте, затем обработайте биотин-конъюгированными вторичными антителами, которые связываются с первичными антителами.

Промойте и инкубируйте с авидином, конъюгированным с ферментом пероксидаза, который связывается с биотином.

Добавьте хромогенный субстрат и окислитель.

Пероксидаза использует агент для преобразования субстрата в цветные осадки, помечая местоположение биомаркера.

Запятнайте ядра, обезвожьте ткань в спирте и установите предметное стекло для визуализации распределения биомаркеров.

Сначала растопите парафин, инкубировав предметные стекла в металлической решетке при температуре 60 градусов Цельсия в течение 20 минут. Затем депарафинизировали предметные стекла с помощью инкубации в регидратационной системе при комнатной температуре в соответствии с протоколом Tex. Храните предметные стекла в водопроводной воде, чтобы предотвратить связывание неспецифических антител. После этого инкубируйте предметные стекла в цитратном буфере при температуре 125 градусов Цельсия в течение 30 секунд при температуре 90 градусов Цельсия в течение 10 секунд. Дайте предметным стеклам остыть, прежде чем пять раз промыть их дистиллированной водой.

Далее инкубируйте предметные стекла при комнатной температуре в 0,3% перекиси водорода в течение 20 минут. Затем промойте слайды в течение пяти минут три раза в буфере для стирки с легким помешиванием. Инкубируйте предметные стекла в течение ночи во влажной камере, установленной при температуре 4 градуса Цельсия, с разведенным первичным антителом. После этого вымойте горки три раза в течение пяти минут с легким помешиванием.

Далее инкубируйте предметные стекла в разведенных биотинилированных вторичных антителах при комнатной температуре в течение часа. Промойте слайды три раза в течение пяти минут в буфере для стирки с легким помешиванием. Затем инкубируйте предметные стекла в биотинилированном комплексе пероксидазы хрена авидина при комнатной температуре в темноте в течение часа. Повторите стирку, как описано ранее. После этого инкубируйте предметные стекла с полосами субстрата с перекисью водорода в течение двух-пяти минут при комнатной температуре.

Промойте горки водопроводной водой и окуните их в раствор гематоксилина, чтобы уравновесить их. Затем тщательно промойте предметные стекла в водопроводной воде, пока вода не станет прозрачной. Обезвоживайте слайды в соответствии с протоколом Tex. Наконец, наденьте на слайды монтажный материал на основе ксилола и дайте им высохнуть на ровной поверхности при комнатной температуре.