Просвечивающая электронно-микроскопическая визуализация эндоцитоза синаптических везикул в нейронах гиппокампа мыши

Начните с лечения нейронов гиппокампа мыши буфером с высоким содержанием калия, содержащим пероксидазу хрена или HRP.

Высокое содержание калия деполяризует пресинаптические нейроны, вызывая экзоцитоз синаптических везикул. Затем нейроны восстанавливают мембраны синаптических везикул через эндоцитоз, включая HRP в новообразованные везикулы. Зафиксируйте нейроны глутаровым альдегидом и промойте для удаления излишков глутарового альдегида.

Добавьте перекись водорода и хромогенный субстрат, который окисляется HRP с образованием электронно-плотных осадков. Промойте, чтобы удалить непрореагировавшую подложку.

Обработайте тетраоксидом осмия для улучшения контраста мембраны, затем смойте излишки реагента. Далее добавьте уранилацетат для усиления контраста органелл.

Обезвоживайте нейроны, используя увеличивающиеся концентрации этанола, и встраивайте их в смолу.

Микроскопически идентифицируйте области с плотностью клеток и удаляйте их. Затем подготовьте ультратонкие срезы.

Перенесите раздел на медную сетку и закрасьте его контрастными веществами.

Используя просвечивающую электронную микроскопию, везикулы, содержащие HRP, выглядят как электронно-плотные структуры.

Стимулируйте культуру нейронов гиппокампа, добавляя 1,5 миллилитра раствора для стимуляции с высоким содержанием калия в каждую лунку при комнатной температуре в течение 90 секунд. На этом этапе приготовьте 0,1 молярного буфера какодилата натрия при pH 7,4. Зафиксируйте клетки с помощью 4% глутаральдегида в 0,1 молярном буфере какодилата натрия не менее чем на один час при комнатной температуре.

Затем промойте клетки три раза 0,1 молярного буфера какодилата натрия каждый раз в течение семи минут. После этого приготовьте раствор DAB и отфильтруйте его с помощью фильтра 0,22 микрометра. Далее нанесите на клетки 1,5 миллилитра раствора DAB на 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия.

Затем промойте клетки три раза 0,1 молярного буфера какодилата натрия каждый раз в течение семи минут. В качестве постфиксации инкубируйте нейроны с 1,5 миллилитрами 1% тетраоксида осмия в 0,1 молярном буфере какодилата натрия в течение одного часа при четырех градусах Цельсия.

После этого промойте нейроны три раза 1,5 миллилитрами 0,1 молярного буфера какодилата натрия каждый раз в течение семи минут. Впоследствии готовят 0,1 молярного буфера ацетата натрия с ацетатом натрия и ледяной уксусной кислотой. Промойте клетки трижды 1,5 миллилитрами 0,1 молярного ацетатного буфера каждый раз в течение семи минут.

После этого инкубируйте клетки с 1,5 миллилитрами 1% уранилацетата в буфере из 0,1 молярного ацетата в течение 1 часа при четырех градусах Цельсия. Затем трижды промойте клетки 1,5 миллилитрами 0,1 молярного ацетатного буфера в течение семи минут каждый раз. В вытяжном шкафу обезвоживайте культуру нейронов с помощью однократных промываний 1,5 миллилитров 50%, 70% и 90% этанола в течение семи минут при каждой промывке, а затем трех промываний 1,5 миллилитрами 100% этанола в течение семи минут каждый раз.

Затем создайте эпоксидную смолу, тщательно перемешайте и храните ее под вакуумом, чтобы удалить пузырьки воздуха. Проникните в образец, заменив этанол на 50% эпоксидную смолу в этаноле в шейкере на 30 минут при комнатной температуре, затем на 70% эпоксидную смолу и этанол на 30 минут при комнатной температуре на шейкере.

Замените раствор эпоксидной смолы на 100% эпоксидную смолу и инкубируйте в течение 10 минут при температуре 50 градусов Цельсия. Выполните две замены свежей 100% эпоксидной смолы. Каждый обмен инкубируется в течение одного часа при температуре 50 градусов Цельсия. Затем добавьте свежую 100% эпоксидную смолу и дайте ей застыть при температуре 50 градусов Цельсия в течение ночи, а затем при 60 градусах Цельсия в течение более 36 часов.

После этого извлеките каждый образец из многолуночной пластины с помощью ручной пилы ювелира. С помощью микроскопа с инвертированным светом выделите интересующие области, которые имеют плотную концентрацию клеток. Затем нарежьте кубиками блоки размером 4 на 5 на 8 миллиметров для секционирования. После этого срезы окрашивают погружением в воду 1% водного раствора уранилацетата на 15 минут, а затем 3% водно-свинцового цитрата в течение 5 минут для улучшения контрастности образцов.