Визуализация активации нейронов гиппокампа в срезах мозга мышей

Начните с участков мозга мыши, обнажающих дорсальный гиппокамп, богатый нейронами.

Добавьте перекись водорода для подавления активности нейрональной пероксидазы, а затем промойте.

Обработайте буфером для пермеабилизации, затем примените блокирующий буфер для блокировки неспецифического связывания.

Добавьте основные антитела и инкубируйте с агитацией. Эти антитела связываются с белками-маркерами активации нейронов.

Промойте и нанесите вторичные антитела, конъюгированные с биотином, для связывания первичных антител.

Промойте и введите комплекс авидин-биотин-пероксидаза, который связывается с биотином на конъюгатах.

Промойте еще раз, затем добавьте хромогенный субстрат, который окисляется пероксидазой для получения коричневого осадка. Остановите реакцию с помощью PBS.

Перенесите разделы на предметное стекло с желатиновым покрытием и обезвожьте их, используя возрастающие концентрации этанола. Затем очистите секции в ксилоле и установите их.

Поместите предметное стекло под светлопольный микроскоп.

При световом освещении неокрашенные участки пропускают свет и кажутся яркими, в то время как окрашенные нейроны поглощают и отражают свет и кажутся темнее.

Отчетливая более темная область указывает на активацию нейронов внутри гиппокампа.

Перенесите от трех до пяти дорсальных участков гиппокампа для каждой мыши в лунки 24-луночного планшета, содержащего 500 микролитров 0,1 молярного PBS для каждой лунки. Промойте срезы, содержащиеся в каждой лунке, 500 микролитрами 0,1 моляра PBS. Все промывки и инкубации выполняйте при комнатной температуре с легким помешиванием, если не указано иное. Под вытяжным шкафом инкубируйте секции в 40% метаноле, 1% перекиси водорода в 0,1 моляре PBS в течение 20 минут, чтобы погасить активность эндогенной пероксидазы.

После еще трех промываний в 0,1 моляра PBS пропитайте срезы, инкубируя их в 500 микролитрах 0,2% Triton X-100 в течение пяти минут. Пока секции инкубируются, подготовьте достаточный буфер блокировки для всего эксперимента. Затем удалите раствор для пермеабилизации и добавьте по 100 микролитров блокирующего буфера в каждую лунку. Инкубируйте секции в течение одного часа.

Затем удалите блокирующий буфер и покройте участки фосфорилированным первичным антителом к внеклеточной регулируемой киназе, разведенным в соотношении 1 к 500 в блокирующем буфере. Инкубируйте секции в течение ночи при температуре 4 градуса Цельсия при осторожном перемешивании. На следующий день, промыв срезы трижды в 0,1 моляре PBS в течение 5 минут каждый, инкубируйте срезы с конъюгированным биотином вторичным антителом, разведенным в соотношении 1 к 250 блокирующим буфером в течение одного часа при комнатной температуре.

Во время инкубации приготовьте реагент ABC не менее чем за 30 минут до использования, чтобы дать достаточно времени для образования комплекса авидина и биотина. Промыв срезы еще три раза 0,1 молярного PBS, добавьте реактив ABC, и дайте ему инкубироваться вместе с образцом в течение 45 минут. Во время следующей серии из трех стирок в PBS приготовьте рабочий раствор для мазка в вытяжном шкафу в соответствии со спецификациями производителя. Нанесите каплю рабочего раствора на пластину.

Затем перенесите секции в лунки, содержащие рабочий раствор DAB, и медленно вращайте пластину, чтобы обеспечить максимальное воздействие раствора на секции. Следите за реакцией DAB на микроскопе до тех пор, пока не разовьется адекватный сигнал примерно через две-пять минут. Остановите реакцию при нужной интенсивности цвета, промыв ткань в 0,1 моляра PBS. После еще трех стирок в PBS установите секции на предметные стекла, покрытые желатином, и высушите их при комнатной температуре не менее трех-четырех часов.

После сушки на воздухе перенесите предметные стекла в вытяжной шкаф и обезвожьте секции, последовательно поместив их в растворы отсортированного этанола на две минуты каждая. Затем очистите предметные стекла в 100% ксилолах в течение пяти минут. Защитите слайды с помощью монтажного носителя и оставьте их в вытяжном шкафу на ночь для высыхания.

Перенесите предметные стекла на светлопольный микроскоп, оснащенный камерой с 20-кратным объективом. Получите несколько изображений светлого поля с каждого участка с 200-кратным увеличением, охватывающим дорсальный гиппокамп. Изобразите от трех до пяти секций каждого животного.