Визуализация внутриклеточной динамики АТФ с помощью сенсоров на основе FRET в органотипическом срезе гиппокампа мыши

Закрепите органотипический срез гиппокампа мыши в экспериментальной камере.

Срез содержит трансдуцированные нейроны и астроциты, экспрессирующие АТФ-сенсор с донорными и акцепторными флуоресцентными белками.

Поместите камеру на столик флуоресцентного микроскопа и профузьте ее кислородосодержащим ACSF.

Позвольте срезу адаптироваться к буферизованным условиям.

Используя свет пропускания, сфокусируйтесь на срезе и определите область интереса.

Переключитесь в режим флуоресценции и возбуждайте донорский флуоресцентный белок, чтобы инициировать флуоресцентное излучение.

При связывании ATP датчик претерпевает конформационные изменения, обеспечивая передачу энергии на основе флуоресценции от донора к акцептору, который излучает флуоресценцию на более длинной длине волны.

Используйте дихроичное зеркало и полосовые фильтры для изоляции и разделения донорского и акцепторного излучения.

Выберите область без флуоресценции для вычитания фона. Затем определите клетки-мишени и зарегистрируйте их флуоресценцию с течением времени.

Рассчитайте отношение FRET для мониторинга внутриклеточных уровней АТФ в режиме реального времени.

Приготовьте экспериментальный ACSF и получите pH 7,4, добавив в него 95% кислород