Двухфотонная визуализация сетчатки мышей in vivo

Возьмем трансгенную мышь под наркозом с головой, закрепленной под углом на держателе, для визуализации сетчатки мыши in vivo.

Сетчатка содержит ганглиозные клетки сетчатки, или РГК, экспрессирующие белок, помеченный флуорофором.

Нанесите смазку для глаз и наденьте на глаз покровное стекло.

Под микроскопом равномерно освещайте сетчатку, чтобы возбуждать флуоресцентные белки в RGC.

Используя излучаемую флуоресценцию, получите широкоугольный вид RGC в фокальной плоскости и RGC вне фокуса.

Переключитесь в режим двухфотонной визуализации, фокусируя низкоэнергетический ближний инфракрасный свет в слое RGC.

В фокусной точке объединенная энергия двух фотонов возбуждает флуорофор, который затем высвобождает энергию в виде флуоресценции.

Поскольку возбуждение ограничено одной точкой, флуоресценция от других фокальных плоскостей сводится к минимуму.

Захватите изображения в нескольких фокальных плоскостях вдоль оси z, чтобы отобразить весь слой RGC.

Нанесите лубрикантные глазные капли на оба глаза мыши. Поверните основной рычаг держателя для головы до тех пор, пока зрачок одного глаза не будет ориентирован на одну линию со световым путем, и поместите покровное стекло с номером 1,5 в компактный держа