Двухфотонная визуализация сетчатки мышей in vivo

Возьмем трансгенную мышь под наркозом с головой, закрепленной под углом на держателе, для визуализации сетчатки мыши in vivo.

Сетчатка содержит ганглиозные клетки сетчатки, или РГК, экспрессирующие белок, помеченный флуорофором.

Нанесите смазку для глаз и наденьте на глаз покровное стекло.

Под микроскопом равномерно освещайте сетчатку, чтобы возбуждать флуоресцентные белки в RGC.

Используя излучаемую флуоресценцию, получите широкоугольный вид RGC в фокальной плоскости и RGC вне фокуса.

Переключитесь в режим двухфотонной визуализации, фокусируя низкоэнергетический ближний инфракрасный свет в слое RGC.

В фокусной точке объединенная энергия двух фотонов возбуждает флуорофор, который затем высвобождает энергию в виде флуоресценции.

Поскольку возбуждение ограничено одной точкой, флуоресценция от других фокальных плоскостей сводится к минимуму.

Захватите изображения в нескольких фокальных плоскостях вдоль оси z, чтобы отобразить весь слой RGC.

Нанесите лубрикантные глазные капли на оба глаза мыши. Поверните основной рычаг держателя для головы до тех пор, пока зрачок одного глаза не будет ориентирован на одну линию со световым путем, и поместите покровное стекло с номером 1,5 в компактный держатель фильтра. Закрепив держатель на предметном столике микроскопа, опустите покровное стекло до контакта со смазкой i-gel, не касаясь роговицы. И отрегулируйте предметный столик в измерении xy и положении объектива по оси z до тех пор, пока широкопольный возбуждающий свет полностью не покроет роговицу.

Используйте окуляр для продолжения регулировки положения по оси Z до тех пор, пока флуоресцентные клетки или структуры сетчатки не окажутся в фокусе, увеличивая эпифлуоресцентный осветитель по мере необходимости для разрешения отдельных клеток или структур, представляющих интерес. Точная настройка выравнивания сетчатки по световому пути изображения. Регулируйте угол наклона головы до тех пор, пока при изменении фокальной плоскости не произойдет только расширение или сжатие расфокусированного света, сводя к минимуму искажения xy.

Затем выключите эпифлуоресцентный осветитель и закройте затвор осветителя. Для двухфотонной визуализации соблюдайте все институциональные протоколы безопасности лазеров. Выключите и закройте весь окружающий свет и переключите путь возбуждающего света на лазер, а путь излучения на ФЭУ

В программном обеспечении для получения изображений установите размер кадра 512 на 512, а среднее значение кадра — 3. Установите z-ступенчатый шаг так, чтобы он начинался в верхней части стека и двигался вниз, сводя к минимуму двухфотонную лазерную активацию фоторецепторов. Включите и включите ФЭУ и отрегулируйте напряжение на 680 вольт.

Включите затворы для визуализации и излучения. Начните предварительный просмотр изображения целевой ткани в реальном времени, начиная с мощности лазера 1%, и автоматически отрегулируйте яркость дисплея для визуализации интересующих клеток или структур. Если ткань-мишень тусклая или нечеткая, увеличивайте процент мощности лазера до тех пор, пока структуры не станут видимыми, не превышая 45 милливатт.

Переместите предметный столик микроскопа в направлении xy, чтобы центрироваться на нужной области изображения, и перейдите в плоскость z, сфокусировав интересующие вас структуры. Для эксперимента с хронической покадровой съемкой откройте ранее полученное изображение, чтобы использовать его в качестве эталона для интересующих клеток, следя за тем, чтобы угол визуализации на текущем изображении был похож на угол изображения на предыдущих изображениях. Затем перейдите к интересующей верхней и нижней плоскостям Z, чтобы задать z-пределы стека изображений и получить изображение.