Флуоресцентная визуализация нейроиммунной динамики с использованием имплантата черепа

Начните с трансгенной мыши, находящейся под наркозом, с круглым стеклянным окном для визуализации и имплантированной на череп головной пластиной.

Микроглиальные или иммунные клетки и нейроны помечены флуоресцентными белками.

Затем закрепите мышь на двухфотонной микроскопической сцене.

Затем введите флуоресцентный краситель внутрибрюшинно, чтобы окрасить кровеносные сосуды в красный цвет.

Очистите стеклянное окно визуализации, нанесите каплю физиологического раствора и опустите объектив микроскопа.

Затем настройте лазерный свет на захват изображения кровеносных сосудов. Запишите шаблон ветвления и координаты, чтобы позже найти и отобразить ту же область.

Теперь настройте лазер на возбуждение флуоресцентных белков, заставляя микроглию и нейроны флуоресцировать.

Используя записанный шаблон ветвления, найдите ту же область и регулярно делайте снимки клеток.

Сосудистая сеть и нейроны остаются стабильными, в то время как положение микроглии меняется с течением времени, отражая иммунную динамику в ответ на активность нейронов.

Просверлите круглое отверстие примерно на 4 миллиметра в черепе с помощью стоматологической бормашины. Во время сверления регулярно увлажняйте череп стерильным физиологическим раствором и ватными тампонами для охлаждения мозга. Очистите костный мусор и размягчите кость черепа.

Когда закончите, осторожно удалите эту часть черепа с помощью заостренных щипцов. После того, как череп будет удален, осторожно поместите в место трепанации черепа небольшой покровный стакан, смоченный физиологическим раствором. Высушите излишки физраствора с помощью стерильной салфетки. С помощью заостренного аппликатора нанесите цианоакрилатный клей вокруг окна и дайте ему прикрепиться к мозгу и черепу.

Нанесите грунтовочный клей на остальную часть черепа и высушите его с помощью полимеризационной лампы в течение 20-40 секунд. Создайте колодец вокруг окна с помощью конечного клея и затвердейте его с помощью полимеризационного света в течение 20-40 секунд. Приклейте небольшую головную пластину на череп на контралатеральной полусфере краниотомии с помощью грунтовочного клея, а затем, с помощью последнего клея, отверждайте оба в течение 20-40 секунд.

После того, как мышь проснется, введите одну подкожную дозу бупренорфина SR в качестве послеоперационной анальгезии, которой будет достаточно в течение 72 часов. Обеспечьте мышь очень мягкой пищей, чтобы способствовать здоровому восстановлению. Визуализация может быть выполнена уже через две недели после операции по имплантации. С помощью винтов закрепите головную пластину на предметном столике двухфотонного микроскопа, который должен поддерживаться на уровне 35 градусов Цельсия с помощью нагревательной пластины.

Введите мышке подкожно 100 микролитров красителя для кровеносных сосудов, такого как родамин В. Аккуратно очистите поверхность черепного окна ватным тампоном, смоченным в 70% этаноле. Налейте на окно несколько капель воды или физиологического раствора и опустите линзу объектива в раствор. Убедитесь, что лазер выключен при опускании объектива.

Нарисуйте от руки карту курса, чтобы обозначить основные ориентиры кровеносных сосудов, глядя в окуляр. Этот рисунок используется для идентификации конкретных областей во время двухфотонной визуализации. Соберите изображения флуоресцентных клеток и сосудов с помощью двухфотонной визуализации. Параметры визуализации см. в текстовой рукописи. Делайте тщательные заметки с соответствующими координатами, чтобы убедиться, что точные регионы можно повторно посетить для последующего изображения.

Соберите несколько полей зрения в этом первом сеансе визуализации.