Энциклопедия экспериментов JoVE
Нейронауки
0 просмотров • 2:19 мин. • May 29th, 2025
Начните с очистки ткани гиппокампа мыши, которая становится оптически прозрачной путем удаления липидов. Ткань встраивается в гидрогелевую сетку для стабилизации биомолекул и сохранения клеточных структур.
Ткань содержит астроциты, экспрессирующие красный флуоресцентный белок, и возбуждающие нейроны, экспрессирующие зеленый ядерный белок, что обеспечивает четкую визуализацию.
Поместите ткань на предметное стекло и создайте камеру с помощью горячего клея, оставив небольшой зазор.
Нанесите раствор для выравнивания показателя преломления, чтобы увлажнить ткань и предотвратить образование пузырей, затем запечатайте покровным стеклом.
Заполните камеру раствором для выравнивания показателя преломления, чтобы уменьшить рассеяние света и закрыть зазор.
Визуализируйте ткань с помощью двухфотонного микроскопа.
Ближний инфракрасный свет возбуждает красные и зеленые флуоресцентные белки в фокальной плоскости, обеспечивая получение изображений с высоким разрешением и минимальными фотоповреждениями. Флуоресцентные излучения детектируются отдельно, что ясно показывает пространственную близость между астроцитами и ядрами возбуждающих нейронов.
Во-первых, поместите образец в центр предметного стекла. С помощью горячего клея создайте стенки по краям горки, почти на высоте ткани. Обязательно оставьте небольшой зазор в одном из углов. По мере приближения слоя горячего клея к высоте среза мозга нанесите на образец одну-две капли согласующего раствора с показателем преломления, чтобы увлажнить верхнюю поверхность и предотвратить образование пузырьков.
Пока горячий клей еще жидкий, заклейте верх покровным стеклом, расположив его максимально равномерно. Затем заполните камеру раствором для выравнивания показателя преломления. Закройте зазор горячим клеем. Если стенки горячего клея выходят за границы горки, обрежьте выступающие края. Если для визуализации используется масляный иммерсионный объектив, добавьте еще два-три миллиметра клея на стены над покровным стеклом, чтобы сохранить раствор для погружения. После этого протокола мозговая ткань будет очищена.