Визуализация синаптогенеза гранулярных нейронов мозжечка на разных стадиях развития

Начните с предварительно фиксированных срезов мозговой ткани, собранных на ранних и поздних постнатальных стадиях у мышей.

Срез содержит гранулярные нейроны мозжечка, или CGN, экспрессирующие флуоресцентный белок.

С помощью конфокального микроскопа сфокусируйтесь на одном флуоресцентном CGN.

Захватывайте z-стековые изображения на разной глубине, чтобы создать трехмерное изображение нейрона.

Используя программное обеспечение для визуализации, отслеживайте нейриты нейронов или длинные проекции, включая дендриты и аксоны.

Измерьте длину дендрита от тела клетки до ее кончика.

Анализируйте образование дендритных когтей, специализированных структур на вершинах дендритов, где принимаются сигналы от других нейронов.

Кроме того, оцените площадь поверхности и объем нейрона.

В то

время как на поздней постнатальной стадии дендритов становится меньше, но их длина и количество когтей увеличиваются.

Таким образом, с возрастом CGN подвергаются синаптогенезу и образуют связи с другими клетками для передачи сигнала.

Чтобы изучить морфологию одиночных электропорированных CGN из сагиттальных срезов мозга экспериментального щенка, сделайте на конфокальный микроскоп изображения z стека с точностью 0,5 микрометра на стек. Отображайте одну ячейку в окне изображения, чтобы упростить анализ изображений и 3D-реконструкцию. Проанализируйте длину нейритов и образование дендритных когтей слепым способом с помощью простого нейритового трассера.

Загрузите одноканальные изображения электропорированных CGN на Фиджи и нажмите на «Плагины», «Сегментация» и «Простой нейритовый трассировщик». Выберите «Создать новое средство 3D-просмотра» в раскрывающемся меню. Прокрутите до основания дендрита, соединяющегося с клеточной сомой, и начните принимать ванну, нажав на соединение. Вручную обведите контур, щелкнув по участкам, где сигнал заполнения ячейки наиболее яркий, и нажав Y, чтобы сохранить трассировку.

Обведите до конца дендрита и подтвердите путь, нажав F. Либо проведите до основания когтя. Далее проведите по когтю от основания структуры до конца самого длинного нейрита. Для трассировки вторичных и третичных ветвей можно удерживать нажатой клавишу Control в Windows или Alt в Mac OS и щелкать по контуру. Подтвердите путь, нажав клавишу F. Обратите внимание, что измерения для трасс видны в отдельном окне. Сложите все размеры ветвей когтей, чтобы получить общую длину каждого когтя

.