Количественное определение вновь сгенерированных нейронов в тканях мозга крыс с помощью метода оптического фракционатора

Возьмите срезы мозга гиппокампа у крысы, которой ввели бромоксиуридин или BrdU, нуклеозидный аналог тимидина.

BrdU встраивается в ДНК во время деления клетки, помечая вновь образованные нейроны в зубчатой извилине, области нейрогенеза.

Инкубируйте с окислителем для инактивации эндогенных ферментов пероксидазы.

Обработайте кислотой для денатурации ДНК и обнажите BrdU, затем нейтрализуйте кислоту.

Инкубируйте с детергентом для проникновения клеточных мембран и блокирующим раствором для маскировки неспецифических участков связывания.

Инкубируйте с первичными антителами, нацеленными на BrdU, с последующими вторичными антителами, меченными пероксидазой, специфичными к первичным антителам.

Введите хромогенный субстрат и окислитель, что позволит пероксидазе превратить субстрат в окрашенный остаток.

Смонтируйте ткань и нанесите противодействие красителем, связывающим нуклеиновые кислоты.

Обезвоживайте ткань, затем обработайте ее для повышения прозрачности.

Под микроскопом определите зубчатую извилину.

Используя технику оптического фракционатора, проанализируйте несколько плоскостей по толщине ткани, чтобы количественно определить нейроны, меченные BrdU.

Когда все будет готово к началу иммуноокрашивания, дайте срезам подойти до комнатной температуры. Затем с помощью кисти перенесите каждый пятый срез из ряда срезов гиппокампа на 25-луночные окрашивающие сетки, помещенные в чашки Петри, наполненные PBS. На каждый гиппокамп должно приходиться от 8 до 12 секций для окрашивания. Переложите сетки для окрашивания, содержащие секции, в соответствующую стеклянную посуду, содержащую PBS, и промойте секции дважды в течение 10 минут в PBS.

Затем инкубируйте в 3% перекиси водорода в течение 20 минут. После промывки пропустите секции через три раствора соляной кислоты. Затем нейтрализовать в 0,1 моляре тетраборат натрия при комнатной температуре в течение 20 минут.

После трех 10-минутных инкубаций в сменах промывочного буфера переведите секции в блокирующий раствор на один час при комнатной температуре. Затем инкубируйте участки в мышином анти-BrdU, разведенном 1 к 100 в блокирующем растворе в течение 48 часов при 4 градусах Цельсия.

После первичной инкубации антител промойте три раза по 10 минут каждый в промывном буфере, затем инкубируйте в течение 48 часов в пероксидазе хрена, разведенной от 1 до 10 в промывном буфере. Через 48 часов перенесите срезы в PBS на 10 минут и повторите в общей сложности пять мытьев. После промывки переложите срезы в раствор DAB на семь минут. Затем переложите в DAB раствор, содержащий 0,02% перекиси водорода, на 10 минут.

После серии промывок установите срезы в нумерованном порядке на предметные стекла микроскопа. Дайте высохнуть примерно 30 минут. Затем высушите образцы на воздухе, поместив их в штатив для слайдов. Затем регидратируйте образцы в течение 10 минут в чашке для окрашивания предметным стеклом, содержащей дистиллированную воду.

Затем переложите предметные стекла до 0,02% кристаллической фиалки в дистиллированную воду на 15 минут. Повторив окрашивание кристаллическим фиолетовым цветом, регидратируйте срезы через серию этанола. Затем дважды очистите срезы в ксилоле в течение 15 минут каждый раз. Наконец, добавьте быстросохнущий монтажный материал и закройте слайды.

Через 24 часа предметные стекла можно использовать для микроскопии. Начните с проверки толщины ткани, сначала поместив предметные стекла на моторизованный предметный столик микроскопа, а затем откройте стереологическое программное обеспечение. Очертите область интереса с помощью объектива с малым увеличением, прежде чем переходить на объектив со 100-кратным погружением в масло.

Затем выберите конкретную точку в учетной рамке, например область, примыкающую к углу, и найдите верхнюю часть сечения, перемещаясь вдоль фокальной плоскости до тех пор, пока какой-либо элемент сечения не окажется в фокусе. Зарегистрируйте эту z-позицию как 0. Затем переместите фокальную плоскость вниз по ткани до тех пор, пока последний z-уровень ткани не окажется в фокусе, затем отметьте это положение. Локальная толщина ткани определяется от 0 до этой конечной точки и может быть считана по оси z.

Зарегистрируйте толщину ткани. Толщина ткани измеряется в нескольких местах в пределах исследуемой области. Высота диссектора и защитной зоны, размер счета, длина шага кадра и окончательное увеличение определяются в пилотном исследовании. Теперь вы можете начать подсчет BrdU-положительных нейронов, обычно при конечном увеличении от 2000 до 3000x, используя 60-кратный масляный или 100-кратный масляный объектив и высокую числовую апертуру.

Определите BrdU-положительные нейроны в каждой системе подсчета, но не учитывайте те, которые касаются красной линии исключения. Посчитайте те BrdU-положительные нейроны, которые касаются зеленой линии включения, и те, которые попадают в границу счетной рамки. Подсчитывайте BrdU-положительные нейроны только в том случае, если интересующая особь четко распознается в пределах высоты диссектора. Показанные здесь полувидимые нейроны не учитываются.