JoVE Encyclopedia of Experiments
Нейронауки
0 просмотров • 2:39 мин • May 29th, 2025
Начните с личинки данио-рерио, содержащей флуоресцентно меченые межневромастные клетки или INMC, установленные на покровном стеколе и помещенные под конфокальный микроскоп.
INMC являются клетками-предшественниками с регенеративной способностью, которые ранее были подвергнуты лазерной абляции.
Сначала понаблюдайте за поврежденным участком в флуоресцентном режиме. Отсутствие флуоресценции подтверждает успешную лазерную абляцию.
Затем используйте режим визуализации в проходящем свете, чтобы исследовать поврежденный участок, где клетка выглядит зернистой и набухшей с неправильными ядрами, подтверждающими гибель клетки.
Привлечение макрофагов к участку указывает на активную клеточную реакцию на повреждение.
Теперь переключитесь обратно в режим флуоресценции и делайте покадровые снимки через равные промежутки времени для мониторинга восстановления.
На этапе восстановления INMC расширяют проекции в промежуток времени, облегчая закрытие и способствуя восстановлению клеток.
Сохраните эти изображения временных рядов для анализа. Повторное появление отчетливой флуоресценции в абляционной области подтверждает успешное восстановление клеток.
Для визуализации тел клеток после абляции в меню «Каналы» снимите щелчок с дорожки DAPI, чтобы инактивировать абляционный лазер, и откройте меню режима съемки. Нажмите кнопку Масштаб и уменьшите масштаб до 0,7.
Чтобы оценить успешность клеточной абляции, быстро просканируйте поле зрения. Используя те же настройки, что и для визуализации перед абляцией, захватите и сохраните изображение после абляции. Изучите изображение канала фотоумножителя проходящего света для дальнейшего подтверждения повреждения ячейки. Поврежденные клетки будут иметь зернистый вид, а ядра будут часто набухать или казаться неправильной формы.
Чтобы оценить восстановление тела клетки после абляции, активируйте параметры положения сцены и времени для съемки покадрового изображения, а также установите временные параметры на соответствующую экспериментальную временную точку и 15-минутные интервалы. Затем начните эксперимент по получению изображений и сохраните полученный файл после завершения.