Кальциевая визуализация активности энтеральных нейронов и глии в миентеральном сплетении толстой кишки мыши

Возьмем, к примеру, камеру визуализации, содержащую иммобилизованную ткань миентерального сплетения толстой кишки мыши, в которой находятся ганглионарные сплетения, состоящие из сетей кишечных нейронов и глиальных клеток.

Эти клетки помечены индикатором кальция, который флуоресцирует при связывании с кальцием.

Далее поместите камеру на предметный столик флуоресцентного микроскопа. Перфузируйте камеру с помощью предварительно подогретого буфера, содержащего ингибиторы для подавления мышечных сокращений во время визуализации.

С помощью микроскопа определите здоровые ганглионарные области, которые проявляют равномерную флуоресценцию.

Получение флуоресцентных изображений для измерения исходной активности, обеспечивающих эталон внутриклеточного уровня кальция.

Перфузируйте ткань агонистом рецепторов для активации нейрональных рецепторов, что провоцирует внутриклеточный приток кальция и увеличение интенсивности флуоресценции.

Активация нейронов косвенно стимулирует окружающие глиальные клетки, что приводит к притоку кальция и последующему увеличению флуоресценции.

Съемка флуоресцентных изображений с интервальной съемкой для измерения изменений интенсивности флуоресценции, которые указывают на динамику кальция и сигнальную активность как в нейронах, так и в глиальных клетках относительно исходных уровней.

Во время инкубации изготовьте модифицированный буфер Креба в соответствии с инструкциями в письменной части протокола и добавьте 3 микромоляра никардипина и 1 микромолярный скополамин для подавления мышечных сокращений во время приема кальция 2 плюс визуализация при рассечении всего монта. Поместите записывающую камеру под флуоресцентный микроскоп и с помощью системы перфузии с гравитационным потоком с несколькими нагреваемыми резервуарами для шприцев установите непрерывную скорость перфузии от 2 до 3 миллилитров в минуту при 37 градусах Цельсия буфера Креба. Убедитесь, что в обоих случаях не образуется пузырьков воздуха, а также в всасывающей линии, подключенной к вакуумному конденсатоотводчику. Сфокусируйте нужное сплетение при яркопольном освещении. Избегайте чрезмерного обнажения ткани, что может привести к фотообесцвечиванию.

Исследуйте флуорофорную нагрузку в ганглиях и выберите здоровые ганглии для визуализации. Нездоровые поврежденные ганглии будут проявлять аутофлуоресценцию или точечную морфологию и не должны использоваться для визуализации. После того, как ганглий выбран, измените путь света на камеру и получите изображение в реальном времени с помощью программного обеспечения для получения изображений. Убедитесь, что ганглий находится в фокусе, и установите скорость получения изображения и время экспозиции.

Скорость и время получения изображений будут варьироваться в зависимости от событий, которые следователи хотят записать. Для большинства экспериментов изображения традиционно получаются с частотой от 0,5 до 1 герц для глиальных клеток и до 2 до 10 герц для нейронов, потому что глиальные кальциевые переходные процессы не такие быстрые, как кальциевые переходные нейроны.

Запустите запись и установите исходный уровень физиологической активности выбранного ганглия при отсутствии экспериментальных стимулов в течение 30 секунд. Затем нанесите предварительно подогретые препараты, представляющие интерес, такие как агонисты и антагонисты рецепторов, используя систему перфузии гравитационного потока со скоростью от 2 до 3 миллилитров в минуту в соответствии с оптимизированным протоколом для вашего препарата. Остановите запись и просмотрите покадровую съемку эксперимента.

Тщательно выбирайте области интереса, или ROI, с помощью соответствующего программного обеспечения для анализа изображений.

Наконец, используйте соответствующее программное обеспечение для визуализации для нормализации и сравнения интенсивности флуоресценции интересующих областей с ее начальным базовым значением. Изменения нормированной флуоресценции прямо пропорциональны изменениям кальция.