Визуализация морфологии астроцитов с помощью флуоресцентного ионофореза красителя в неподвижном срезе мозга мыши

Поместите химически закрепленный срез мозга мыши в стеклянную донную чашку с буфером и закрепите ее сеткой.

Подсоедините электрод, заполненный анионным гидрофильным флуоресцентным красителем, к источнику напряжения.

Вставьте заземляющий электрод в буфер, чтобы замкнуть электрическую цепь.

Используя светлопольное освещение, продвиньте заполненный красителем электрод к срезу.

Переключитесь на инфракрасную дифференциально-интерференционно-контрастную визуализацию для определения местоположения астроцита.

Проткните сому астроцита электродом, чтобы получить доступ к цитоплазме.

Подайте электрический ток для введения красителя в цитоплазму с помощью ионофореза.

Переключитесь на конфокальную микроскопию для контроля движения красителя.

Гидрофильный краситель, неспособный пересечь гидрофобную мембрану, диффундирует в цитоплазме, заполняя сому и ветви.

Как только ячейка заполнится, остановите ток и вытащите электрод.

Дайте мембране астроцитов восстановиться.

Получение изображений в различных Z-плоскостях и их реконструкция для визуализации морфологии астроцитов.

Для теста на инъекцию красителя аккуратно поместите слегка закрепленный срез мозга в стеклянную миску на дне, наполненную 0,1 моляра PBS при комнатной температуре. И удерживайте срез на месте с помощью платиновой арфы с нейлоновыми струнами.

Подключите электрод к источнику напряжения и поместите заземляющий электрод в ванну с срезом мозга. Переместите объектив конфокального микроскопа в интересующую область мозга.

И опустите электрод в раствор с помощью 10-кратной водоиммерсионной линзы, переместив электрод к центру поля зрения. Затем под светлым полем медленно опустите электрод к срезу, остановившись чуть выше поверхности.

Чтобы заполнить интересующий астроцит ионофорезом, используйте инфракрасный дифференциальный интерференционный контраст для идентификации астроцитов с удлиненными соматами овальной формы, диаметром около 10 микрометров, на 40-50 микрометров ниже поверхности среза.

Это лучистый слой гиппокампа непосредственно под пирамидальным клеточным слоем. По мере продвижения по тканям мы можем видеть кровеносные сосуды, нейроны, астроциты и другие типы клеток.

После того, как астроцит выбран, переместите клетку в центр поля зрения и медленно опустите кончик электрода в срез. Навигация по ткани до тех пор, пока электрод не окажется в одной плоскости с телом клетки.

Как только клеточное тело астроцита станет четко видимым и очерченным, медленно и осторожно продвигайте электрод вперед, перемещая электрод до тех пор, пока кончик не пронзит сому клетки.

Медленно перемещайте фокус объектива вверх и вниз, чтобы отметить, находится ли электрод внутри сомы. Как только наконечник электрода окажется внутри ячейки, включите стимулятор на напряжение от 0,5 до 1 вольта, чтобы непрерывно выбрасывать ток в ячейку.

С помощью конфокального микроскопа наблюдайте за заполнением ячейки, увеличивая цифровое увеличение, чтобы визуализировать детали клетки и убедиться, что кончик электрода виден внутри ячейки по мере необходимости.

Подождите около 15 минут, пока не появятся более мелкие ветви и процессы, прежде чем выключить напряжение и осторожно вытащить наконечник электрода из элемента.

Чтобы получить изображение заполненной ячейки, подождите от 15 до 20 минут, пока ячейка вернется в исходную форму, прежде чем отрегулировать настройку на конфокальном микроскопе, чтобы убедиться, что более тонкие ветви и процессы выглядят четко под объективом 40x.

Установите z-стек с шагом 0,3 микрометра, перемещая объектив во время визуализации до тех пор, пока сигнал от ячейки не исчезнет. И установите этот шаг в качестве верха.

Затем переместите объектив вниз, фокусируясь по ячейке до тех пор, пока сигнал не исчезнет. И установите эту ступень в качестве нижней.