Визуализация кальция in vitro в краткосрочных и долгосрочных культурах гиппокампа крыс

Возьмем краткосрочную культуру нейронов гиппокампа крысы, представляющую молодые нейроны, и долгосрочную культуру, представляющую старые нейроны.

Стареющие нейроны демонстрируют более высокую плотность потенциал-зависимых кальциевых каналов L-типа, или L-VGCC, которые остаются открытыми в течение более длительного времени после деполяризации мембраны.

Инкубируйте с флуоресцентным индикатором кальция, который диффундирует в клетки, затем промойте, чтобы удалить излишки красителя.

Поместите культуры в перфузионную камеру под флуоресцентным микроскопом.

Введите раствор, содержащий нейротрансмиттеры, которые связываются с рецепторами на нейронах, индуцируя приток ионов натрия и запуская деполяризацию мембраны.

Деполяризация активирует L-VGCC, обеспечивая приток кальция в цитоплазму.

В культуре длительного времени более высокая плотность и длительное открытие L-VGCC приводит к перегрузке кальцием, что является отличительной чертой старения нейронов.

Связывание кальция с индикатором генерирует флуоресценцию, при этом старые нейроны демонстрируют более высокую интенсивность флуоресценции, отражая повышенный внутриклеточный уровень кальция при стимуляции.

При этой процедуре клетки инкубируют с Фура2-АМ в течение 60 минут при комнатной температуре в темноте, затем переносят покровные стекла в перфузионную камеру. После этого поместите перфузионную камеру с покровным стеклом в держатель на перевернутый микроскоп. Выберите микроскопическое поле и непрерывно перфузируйте клетки предварительно подогретым HBS.

Затем эпи-освещение клеток на 340 и 380 нанометрах в конечном итоге, а затем запись света, излучаемого на 520 нанометров каждые 5-10 секунд, с помощью флуоресцентной камеры, которая фильтруется дихроичным зеркалом Fura-2. Для анализа записанных флуоресцентных изображений. Сначала откройте файл эксперимента.

С помощью программного обеспечения AquaCosmos нажмите на «Ratio» и выберите желаемый диапазон соотношений. Рассчитайте попиксельное соотношение в полученных изображениях, чтобы получить последовательность изображений с соотношением. Затем вычтите фон, отрегулировав кнопку подсветки фона. После этого нажмите «Начать расчет». затем нажмите кнопку All Time Sequence и сотрите древние ROI.

Для количественного анализа отдельных клеток установите новые ROI или ROI, соответствующие отдельным нейронам. Чтобы построить график отдельных записей, экспортируйте значения коэффициента флуоресценции, соответствующие каждому ROI, в исходную лабораторную программу, нажав кнопку «График». Затем нажмите «Рассчитать» и сохраните файл TXT. После этого сделайте соответствующий расчет для оценки величины повышения коэффициента флуоресценции в ответ на каждую стимуляцию.