JoVE Encyclopedia of Experiments
Нейронауки
0 просмотров • 3:14 мин • May 29th, 2025
Начните с отделов мозга на нейродегенеративной модели мыши.
Инкубируйте с блокирующим раствором с добавлением моющего средства, чтобы увеличить проницаемость тканей и блокировать неспецифическое связывание. Выбросьте раствор.
Вводите первичные антитела, нацеленные на бета-амилоидные бляшки. Инкубируйте с возбуждением, чтобы антитела взаимодействовали с бета-амилоидными бляшками, затем промойте.
Добавьте вторичные антитела, помеченные красным флуорофором, и инкубируйте в темноте, чтобы антитела могли взаимодействовать.
Промойте для удаления несвязанных антител, затем промойте спиртом.
Добавьте куркумин, который связывает богатые бета-листами амилоиды с высоким сродством, затем умойтесь.
Далее проводят лечение с повышением концентрации алкоголя, обезвоживающим отделы головного мозга. Добавьте ксилол, чтобы удалить следы реагентов.
Установите срез на предметное стекло и наблюдайте под флуоресцентным микроскопом.
Используйте лазер с длиной волны 590 нанометров, чтобы возбудить красные флуорофоры на вторичных антителах. Сделайте снимок.
Переключитесь на лазер с длиной волны 480 нанометров, чтобы возбуждать куркумин, излучающий зеленую флуоресценцию.
Наложите изображения; красная и зеленая флуоресценция подтверждает наличие бета-амилоидных бляшек в тканях мозга.
Для мечения срезов криостата анти-А бета-антителами промывают образцы три раза свежим PBS на одну промывку в отдельных лунках 12-луночного планшета перед блокированием любого неспецифического связывания 10% нормальной козьей сывороткой в PBS и 0,5% Triton x-100 в течение одного часа при комнатной температуре.
В конце инкубации выбросьте блокирующий раствор и инкубируйте образцы с бета-специфическим антителом А в течение ночи при температуре 4 градуса Цельсия и 150 оборотах в минуту. На следующее утро промойте срезы тремя 10-минутными промывками в свежем PBS за промывку с последующей инкубацией с соответствующим вторичным антителом, конъюгированным с красным флуорофором, в течение одного часа при комнатной температуре, защищенной от света.
В конце инкубации промойте секции три раза PBS, а затем одну промывку 70% спиртом. После промывки спиртом срезы инкубировать с 10 микромолярами куркумина в течение 10 минут при комнатной температуре, а затем провести три промывки 70% спиртом по одной минуте.
После последней промывки обезвоживайте секции 90% и 100% спиртом в течение одной минуты для каждой концентрации и очищайте секции два раза в течение пяти минут за погружение свежим ксилолом за инкубацию. Затем смонтируйте и изобразите секции, как показано на рисунке.