Трехмерная визуализация вирусной инфекции бешенства в тканях головного мозга мышей

Возьмите фиксированный толстый участок мозга у мыши, зараженной вирусом бешенства.

Вирус заражает нейроны и реплицируется, в результате чего вирусные белки присутствуют в клетках.

Обработайте моющим средством для проникновения клеточных мембран и блокирующим раствором для маскировки неспецифических участков связывания.

Инкубируйте с первичными антителами, нацеленными на вирусные белки, с последующими вторичными антителами, конъюгированными с флуорофорами, которые связываются с первичными антителами.

Обработайте флуоресцентным красителем, связывающим нуклеиновые кислоты, чтобы пометить ядро.

Обезвоживайте ткань в возрастающей концентрации спирта, затем нанесите очищающий раствор для повышения прозрачности тканей для визуализации.

Установите секцию в камеру визуализации, заполните ее очищающим раствором и запечатайте.

Используя конфокальную лазерную сканирующую микроскопию, визуализируйте ткань отдельно с помощью флуоресцентных меток, а затем объедините их для создания двумерного изображения.

Получайте изображения в разных фокальных плоскостях ткани и объединяйте их для создания трехмерного представления для оценки прогрессирования инфекции.

Для иммуноокрашивания участков ткани головного мозга промывают образцы два раза в течение 1 часа в 4 миллилитрах 0,2% Triton X-100 в PBS с последующей пермеабилизацией в течение двух дней при 37 градусах Цельсия, в 4 миллилитрах 0,2% Triton X-100, 20% диметилсульфоксида и 0,3 молярного глицина в PBS. Блокируйте любое неспецифическое связывание с помощью 4 миллилитров 0,2% Triton X-100, 10% диметилсульфоксида и 6% нормальной сыворотки в PBS в течение двух дней при 37 градусах Цельсия.

В конце блокирующей инкубации пометьте образцы 2 миллилитрами первичного раствора антитела в течение пяти дней при температуре 37 градусов Цельсия, обновив раствор антитела через два с половиной дня. Затем промойте образцы в течение одного дня в 4 миллилитрах 0,2% Tween 20 и 10 микрограммах на миллилитр гепарина в PBS, меняя буфер для промывки не менее четырех-пяти раз в течение дня и оставьте окончательную промывку на ночь.

На следующий день инкубируйте образцы в 2 миллилитрах раствора вторичных антител в течение пяти дней при температуре 37 градусов Цельсия. Затем промойте образцы в 4 миллилитрах свежего 0,2% Tween 20 и 10 микрограммах на миллилитр гепарина в PBS, как показано на рисунке.

Для ядерного окрашивания образцов образцы инкубируют в 4 миллилитрах красителя нуклеиновой кислоты TO-PRO-3 в течение 5 часов, защищенных от света. В конце инкубации промыть образцы в 0,2% Tween 20 и 10 мкг на миллилитр гепарина в PBS, как показано на рисунке, с последующей дегидратацией в восходящем ряду трет-бутанола в течение 2 часов за одно погружение.

После 90% погружения перенесите образцы в 96% раствор трет-бутанола на ночь. На следующее утро обезвоживайте образцы в 100% трет-бутаноле в течение 2 часов, а затем очистите участки ткани в свежеприготовленном BABB-D15 в течение 2-6 часов, пока они не станут оптически прозрачными. Затем образцы можно хранить в BABB-D15, защищенном от света, до их монтажа и визуализации.

Для монтажа образца используйте 3D-принтер, чтобы напечатать камеру визуализации и крышку. Установите покровное стекло диаметром 30 мм на камеру визуализации с помощью однокомпонентного силиконового каучука, вулканизирующего при комнатной температуре. Аналогичным образом закрепите на крышку 22-миллиметровый покровный листок. С помощью ватного тампона, смоченного в воде, удалите излишки силиконовой резины на обоих кольцах, прежде чем дать резине застыть в течение ночи.

На следующий день поместите образец в камеру визуализации и добавьте в камеру небольшой объем BABB-D15 перед тем, как вставить крышку. С помощью иглы для подкожных инъекций заполните камеру BABB-D15 через входное отверстие и закупорьте входное отверстие, прежде чем герметизировать камеру визуализации силиконовым каучуком.

Чтобы настроить получение изображения, выберите соответствующие лазерные линии для используемых флуорофоров и отрегулируйте диапазоны обнаружения каждого детектора, чтобы предотвратить перекрытие сигнала между каналами. Затем задайте параметры сбора, определите верхнюю и нижнюю границы стека и получите стек изображений.

Чтобы создать 3D-проекции стека изображений, откройте файлы изображений на Фиджи и выберите «Изображение», «Цвет», инструмент «Каналы», «Еще» и «Разделить каналы», чтобы разделить объединенные изображения на отдельные каналы. Для коррекции обесцвечивания изображений для каждого канала выберите Изображение, Настройка, Коррекция отбеливания и выберите Простое соотношение. С помощью ползунков отрегулируйте яркость и контрастность для каждого канала и выберите «Изображение», «Цвет» и «Объединить каналы». Отметьте галочкой опцию Создать композит.

Преобразуйте изображение в формат RGB и выберите «Изображение», «Стопки» и «3D-проект», чтобы создать 3D-проекцию. Выберите самую яркую точку в качестве метода проекции и установите расстояние между срезами в соответствии с размером Z-шага полученного стека изображений. Для максимального качества установите приращение угла поворота равным 1 и включите интерполяцию. При необходимости измените параметры «Общий поворот», «Пороги прозрачности» и «Непрозрачность». Затем сохраните 3D-проекцию как . Форматы файлов TIFF и .AVI.