Визуализация проекций моторных нейронов и ветвления аксонов с помощью флуоресцентной микроскопии световых листов

Возьмите химически фиксированный и очищенный сегмент ткани из трансгенного эмбриона мыши, экспрессирующего зеленый флуоресцентный белок (GFP) в спинномозговых моторных нейронах.

Установите салфетку вертикально на модифицированный наконечник пипетки.

Прикрепите наконечник к капилляру, закрепленному внутри светового листа флуоресцентного микроскопа.

Поместите заполненную буфером камеру для образцов под ткань, чтобы погрузить ее в нее и очистить от мусора.

С помощью программного обеспечения для визуализации выровняйте ткань по световому пути.

Начните получение изображения.

Источник света излучает тонкий слой лазерного света, возбуждая GFP в одной плоскости ткани для излучения флуоресценции.

Детектор, расположенный перпендикулярно световому тракту, улавливает излучаемую флуоресценцию.

Получение изображений спинальных мотонейронов для создания 3D-реконструкции морфологии ветвления аксоналов.

Используйте программное обеспечение для картирования аксонов, выявления шаблонов ветвления и конечных точек для оценки роста и связи моторных нейронов.

Настройка оптики подсветки 5X/0.1 и оптики обнаружения 5X/0.16. Соберите держатель образца и капилляр для образца. Подготовьте камеру для образцов, заполнив ее очищающим раствором. Чтобы установить эмбрион, подготовьте наконечник пипетки P200, отрезав верхнюю часть так, чтобы она соответствовала диаметру капилляра, и удалите заостренную часть для крепления образца.

Затем расплавьте затупленный конец наконечника пипетки с помощью небольшого пламени. Потушите пламя и быстро приложите зародыш вертикально к расплавленному концу. Подогните верхнюю часть наконечника пипетки к капилляру образца и поместите подготовленную камеру для образца в микроскоп. С помощью программного обеспечения для обработки изображений выберите «Найти капилляр» на вкладке «Найти» и настройте оси xy и z.

Затем выберите «Найти образец» и увеличьте масштаб до 0,6X, чтобы сфокусироваться на эмбрионе. Дайте буферу камеры уравновеситься с эмбрионом в течение некоторого времени, чтобы очистить его от мусора или пузырьков. Для получения изображений на вкладке Acquisition (Получение) задайте параметры пути прохождения света, такие как объекты обнаружения, фильтр блокировки лазера, светоделитель, камеры и лазеры.

Установите флажок Pivot scan для уменьшения теней. Затем определите параметры сбора данных, разрядность до 16 бит. Увеличьте масштаб в диапазоне от 0,36 до 0,7X при одностороннем или двустороннем освещении. Нажмите «Непрерывный» и задайте интенсивность лазера, время экспозиции, мощность лазера и положение светового листа. Затем нажмите стоп, чтобы завершить получение изображения.

Важно убедиться, что прозрачный образец расположен на кратчайшем пути света, чтобы обеспечить детальное получение изображений тонких вертикальных структур на отдельных двигательных нервах.

Для многомерного сканирования определите стек Z, переместив положение Z для первого и последнего изображения. Нажмите кнопку Оптимальный, чтобы задать номер среза. Затем нажмите кнопку «Начать эксперимент», чтобы получить выбранный стек Z. Когда это будет сделано, сохраните изображение в формате dot CZI.

Чтобы количественно оценить арборизацию аксонов, откройте файл изображения в программном обеспечении для анализа изображений. Отрегулируйте цвет, яркость и контрастность изображения с помощью окна настройки дисплея для обнаружения нитей на основе контраста локальной интенсивности. Далее нажмите на иконку «Добавить новые нити» и выберите алгоритм автоматического пути в выпадающем меню. Выберите интересующий регион.

Затем определите начальную и начальную точки, назначив самые большие и тонкие измерения диаметра, которые можно измерить в режиме среза. Назначьте начальную точку на краю области интереса. Чтобы вручную добавить или удалить начальные точки, сначала измените режим указателя, выберите навигацию, а затем нажмите Shift и щелкните правой кнопкой мыши на точках интереса.

Затем выберите Ручные пороговые значения для начальных точек, чтобы убедиться, что все видимые арборизации помечены. Затем вручную добавьте или удалите начальные точки. Установите флажок «Удалить разъединенные сегменты» и удалите начальные точки вокруг начальных точек. Затем отрегулируйте порог для вычитания фона и завершите процесс.

Необходимо удалить фоновые артефакты и подтвердить, что траектория детектора отражает истинную арборизацию аксонов для точной количественной оценки.

В конце выберите нужный стиль и цвет. На вкладке Статистика выберите подробный и используйте дендритные концевые точки номера нити для количественной оценки окончаний двигательных нервов в качестве индикатора арборизации моторных аксонов. Затем экспортируйте изображение восстановленного аксона в формате . Файл TIFF.