Гистохимическая визуализация корковых модулей в уплощенных срезах мозга

Начните с заранее зафиксированных тангенциальных участков уплощенных корковых участков головного мозга. Промойте для удаления фиксирующих следов. Промойте

срезы раствором диаминобензидина или DAB и сульфатом никеля-аммония.

DAB диффундирует в нейроны коры головного мозга и вступает в реакцию с цитохромоксидазой в митохондриях, образуя темный осадок. Сульфат никеля и аммония затемняет осадок, усиливая контраст.

Добавьте параформальдегид, чтобы остановить реакцию окрашивания, затем прополощите.

Установите секции на предметное стекло и обезвожьте их с помощью этаноловых смывок.

Промойте изопропанолом и ксилолом, чтобы очистить секцию и улучшить светопропускание.

Нанесите монтажный носитель и наденьте на него покровное стекло.

При изображении под светлопольным микроскопом внутри нейронов коры головного мозга осадки поглощают и рассеивают свет, делая их темными.

Напротив, неокрашенные, очищенные участки пропускают свет и кажутся яркими.

Этот контраст выделяет корковые модули как темные, пятнистые структуры на более светлом фоне, представляющие собой активные нейронные кластеры, участвующие в обработке сенсорной информации.

Промойте ткань секции в буфере HEPES в течение 15 минут с легким перемешиванием. Во время стирки приготовьте свежий раствор для окрашивания цитохромоксидазы и добавьте компонент DAB непосредственно перед его использованием. Теперь инкубируйте срезы в свежеприготовленном растворе для окрашивания при комнатной температуре с помощью шейкера. И следите за происходящим. В зависимости от объема фиксации, окрашивание может быть заметно через 10 минут, а может занять несколько часов.

Если реакция протекает слишком медленно, увеличьте температуру до 37 градусов по Цельсию. Чтобы остановить реакцию, переложите секции в ванну с 4% PFA и дайте им поинкубироваться в течение 15 минут при легком перемешивании. Затем промойте секции три раза с буфером HEPES в течение 10 минут за одну стирку.

Теперь установите и высушите секции на стеклянных предметных стеклах и обезвожьте их, используя все более сильные ванны с этанолом. Затем промойте предметные стекла в изопропаноле в течение 5 минут, а затем в ксилоле в течение пяти минут. После ванны с ксилолом сразу же добавьте быстро затвердевающую монтажную среду без водной основы. Среды на водной основе ухудшают пятно. После добавления покровного стекла храните предметные стекла при температуре 4 градуса Цельсия до получения изображения.