Анализ иммунных клеток в нервных тканях мышей с помощью проточной цитометрии

Возьмите клетки, выделенные из седалищных нервов мышей и ганглиев дорсальных корешков или DRG.

Инкубируйте с мечеными флуорофорами антителами против CD45 и CD11b, а также с меченными биотином антителами против MHC класса II, чтобы пометить иммунные клетки.

Инкубируйте с меченным флуорофором стрептавидином, который связывается с биотином.

Обработайте фиксатором для стабилизации клеточной структуры.

Введите буфер для пермеабилизации с флуоресцентным окрашиванием ДНК для проникновения мембран и мечения ядер.

С помощью проточного цитометра пропустите клетки через лазерный луч для оценки оптических и флуоресцентных характеристик.

Удалите агрегаты с более высокой флуоресценцией ДНК, чтобы изолировать отдельные клетки и обнаружить флуоресценцию из маркеров.

Идентифицировать клетки, экспрессирующие CD45, характерный маркер иммунных клеток, подтверждающий их наличие.

Большинство CD45-положительных клеток в DRG экспрессируют CD11b и MHC класса II, что указывает на микроглию, подобную клетке, которая отсутствует в седалищных нервах.

Этот метод дополняет визуализацию для анализа гетерогенности иммунных клеток в нервных тканях.

На компьютере выберите подходящие каналы для детектирования интересующих флуорофоров, соответствующую скорость потока для образцов и общее количество событий, которые должны быть собраны для каждого образца. Минимальное количество событий должно составлять 1 миллион.

Затем создайте диаграммы рассеяния под глобальным рабочим листом бокового рассеяния A и прямого рассеяния A, а также для каждого интересующего флуорофора и прямого рассеяния A. Кроме того, создайте статистическое представление, в котором будет отображаться количество событий и средняя интенсивность флуоресценции для выбранных флуорофоров.

Определите родительский вентиль P1 на основе диаграммы рассеяния, полученной от элементов управления окрашиванием только DAPI. Приложите образец к проточной цитометрии и нажмите «Получить». Наблюдайте за графиком зависимости DAPI от FSC и снижайте напряжение канала DNA Pacific Blue до тех пор, пока популяция DAPI-plus не станет видимой. С помощью инструмента стробирования прямоугольника нарисуйте прямоугольник вокруг популяции DAPI-plus. Он представляет собой вентиль P1. Выберите точечные диаграммы для каждого из флуорофоров и отобразите только события DAPI-plus. Он представляет собой фоновую флуоресценцию для каждого из флуорофоров.

С помощью инструмента стробирования прямоугольника нарисуйте прямоугольник на диаграммах рассеяния для каждого из флуорофоров, начиная со 103 по оси y. Этот вентиль представляет область, в которой должны быть найдены положительные события для каждого из указанных маркеров. Отрегулируйте напряжение для каждого из флуорофоров с помощью элементов управления окрашиванием, предназначенных только для DAPI. Приложите образец к проточной цитометрии и нажмите «Получить».

Наблюдайте за положением популяции DAPI-plus для каждого из флуорофоров и регулируйте соответствующие напряжения таким образом, чтобы популяции выходили за пределы прямоугольного затвора. После настройки проточного цитометра запустите образцы и экспортируйте файлы прямого рассеивания для дальнейшего анализа.