Покадровая визуализация радиальной миграции корковых нейронов в трансдуцированных срезах эмбрионального мозга мыши

Возьмем мембранную вставку, содержащую трансдуцированные эмбриональные органотипические срезы мозга мыши, где нейроны и радиальные глиальные клетки экспрессируют флуоресцентные белки, что позволяет их визуализировать.

С помощью флуоресцентной микроскопии выберите срез с флуоресцентными корковыми нейронами, мигрирующими радиально к пиальной поверхности среза, используя неповрежденные радиальные глиальные скаффолды.

Перенесите мембранный вкладыш с выбранным ломтиком в чашку со стеклянным дном с фильтрующим материалом для поддержки клеточной активности во время визуализации.

Поместите чашку в камеру с климат-контролем инвертированного конфокального микроскопа, чтобы убедиться в жизнеспособности клеток.

Отрегулируйте параметры изображения, чтобы получать четкие изображения и свести к минимуму фотоповреждения.

Затем настройте Z-стек в целевой области для визуализации ячеистых структур.

Запускайте интервальную съемку через равные промежутки времени.

Проанализируйте изображения, чтобы оценить радиальную миграцию корковых нейронов из субвентрикулярной зоны к корковой пластинке по радиальным глиальным скаффолдам, выделив закономерности миграции нейронов.

Выберите срез мозга для визуализации, рассматривая срезы через перевернутый микроскоп. Выберите срез с яркими одиночными нейронами в верхней части СВЗ, мигрирующими радиально к пиальной поверхности среза.

Наличие тонких флуоресцентных отростков радиальных глиальных клеток, которые охватывают всю кортикальную пластинку, указывает на интактный радиальный глиальный каркас, который используется мигрирующими корковыми нейронами.

Переложите мембранный вкладыш с выбранным ломтиком в стеклянную посуду со стеклянным дном диаметром 50 миллиметров, содержащую 2 миллилитра питательной среды. Поместите чашку в климатическую камеру конфокального микроскопа.

Установите разрешение 512 на 512 пикселей. Увеличьте скорость сканирования с 400 Гц до 700 Гц, чтобы увеличить частоту кадров примерно с 1,4 до примерно 2,5 кадров в секунду. Используйте не более двух раз усреднения.

Определите Z-стек через электропорированную область с шагом 1,5 мкм. Начните серию интервальной съемки, снимая Z-стек каждые 30 минут. Описанные настройки позволяют обеспечить достаточное разрешение и яркость изображения, сохраняя при этом низкий уровень фотоповреждений во время съемки.