Селективная однонейронная лазерная абляция у личинки данио-рерио с использованием конфокального микроскопа

Возьмите предварительно подогретый раствор агарозы, содержащий обезболенную трансгенную личинку данио-рерио, экспрессирующую флуоресцентный белок в спинномозговых двигательных нейронах.

Перенесите личинку в стеклянную посуду с агарозным кольцом.

С помощью микроскопа переверните личинку на бок. Затем дайте агарозе застыть, обездвижив личинку.

Добавьте буфер с анестетиком для поддержания анестезии.

Поместите чашку на предметный столик конфокального микроскопа и с помощью визуализации в светлом поле определите местоположение дорсальной области спинного мозга.

Переключитесь в режим флуоресценции для визуализации флуоресцентных моторных нейронов.

Определите центральную z-плоскость сомы клетки для точной абляции.

Настройте параметры визуализации для получения изображений с высоким разрешением, минимизируя при этом фотоповреждение.

Как только желаемая z-плоскость окажется в фокусе, выполните абляцию целевой области нейронов с помощью сфокусированного ультрафиолетового лазера.

Лазерная энергия разрушает клеточные структуры, вызывая потерю флуоресценции и гибель клеток. Необратимая потеря флуоресценции подтверждает точную абляцию без воздействия на окружающие клетки.

С помощью регулируемой пипетки вытяните личинку и дайте ей опуститься на дно кончика. Опустите личинку в минимальном объеме жидкости в разогретую агарозу, затем наберите рыбу с агарозой и быстро выложите ее в заранее подготовленное стеклянное дно 35-миллиметровой посуды. Под микроскопом для вскрытия используйте стандартную кисть, чтобы расположить животное или нескольких животных внутри агарозы на боку так, чтобы тело и хвост были плоскими.

Дайте погруженной рыбе постоять от 10 до 15 минут, пока агароза не застынет. Затем используйте примерно два миллилитра яичной воды с триканом, чтобы аккуратно долить 35-миллиметровую чашку Петри. Поместите чашку Петри со встроенной личинкой на предметный столик конфокального микроскопа и, используя световое освещение и 40-кратное увеличение, сфокусируйтесь на дорсальной стороне спинного мозга животного. Переключитесь на соответствующую флуоресцентную настройку и визуализируйте интересующую структуру, чтобы убедиться, что все параметры визуализации соответствуют необходимым для последующей абляции.

Чтобы определить толщину структуры для УФ-лазерной абляции, используйте Z-привод для проверки верхней и нижней части интересующей структуры, вручную фокусируясь вверх и вниз. Вручную запишите плоскость Z, которая будет удаляться, например, центр ячейки. Чтобы провести лазерную абляцию, запустите мастер FRAP, нажав на выпадающее меню в верхней части меню программного обеспечения.

В новом окне определите параметры изображения для абляции, выбрав формат, скорость сканирования и усреднение. Если плоскость Z для абляции еще не выбрана, нажмите кнопку реального времени и сфокусируйтесь на образце, пока флуоресцентная структура или желаемая плоскость Z, которую необходимо абляировать, не окажется в фокусе. После того, как общие параметры изображения установлены, перейдите к этапу отбеливания для управления конкретными компонентами абляции, а затем активируйте 405-нанометровый лазер, активировав его для процедуры отбеливания.

Затем используйте опцию увеличения, чтобы максимизировать интенсивность обесцвечивания при выбранной ROI за счет уменьшения поля сканирования, тем самым максимизируя время задержки. Выберите один или несколько ROI для абляции с помощью любого из инструментов рисования в окне получения изображения. Нацеливайтесь на бугорок аксона, например, с помощью инструмента для кругового рисования размером примерно от 4 до 8 микрометров.

После установки ROI нажмите кнопку «Временной ход» и подтвердите количество циклов, в течение которых ROI будут сканироваться и удаляться. Выберите рамки до и после отбеливания по своему усмотрению, чтобы обеспечить обзор всего изображения непосредственно перед и сразу после процесса отбеливания.

Эти настройки позволяют исследователям выполнять несколько слоев уточнения. Благодаря регулировке мощности лазера, скорости сканирования, усреднения линий, размера области интереса и повторений, этот метод обеспечивает высокую степень свободы для создания стресса или смерти в отдельных клетках.

После установки всех необходимых параметров абляции нажмите Run experiment и следите за эффективностью абляции. Обратитесь к текстовому протоколу для получения дополнительной информации.