Энциклопедия экспериментов JoVE
Нейронауки
0 просмотров • 3:35 мин. • May 29th, 2025
Возьмем химически фиксированный мозг мышиного детеныша с церебральными кавернозными мальформациями или КМК — скоплениями аномальных кровеносных сосудов, заполненных застоявшейся кровью.
Изолируйте задний мозг, промойте буфером и инкубируйте в растворе для окрашивания на основе йода.
Йод проникает через проницаемые кровеносные сосуды в зонах КМК, связывается с компонентами крови и усиливает контраст поражения.
Высушите ткань на воздухе, чтобы удалить излишки красящего раствора.
Поместите ткань в пробирку и запечатайте, чтобы предотвратить усадку ткани.
Закрепите трубку внутри трубки большего размера с помощью губок и установите ее вертикально в держатель микро-КТ.
Запустите сканирование.
Источник рентгеновского излучения излучает концентрированные рентгеновские лучи, которые проходят через ткани.
Участки, окрашенные йодом, поглощают больше рентгеновских лучей, чем окружающие ткани.
Детектор записывает проходящие рентгеновские лучи, генерируя изображения, на которых КМК кажутся ярче.
Система вращает ткань, захватывая 2D-изображения под разными углами.
Специализированное программное обеспечение реконструирует эти изображения в 3D-модель, выявляя места КМК в мозге.
Начните подготовку образца с наполнения 10-миллилитрового шприца, оснащенного иглой 29-го калибра, тремя миллилитрами 2% параформальдегида в PBS. Затем проведите внутрисердечную перфузию усыпленному щенку P8, вставив иглу в желудочек мышиного сердца и медленно вводя полный объем параформальдегида.
После использования ножниц для отделения головы, снимите кожу с головы и снимите череп, используя щипцы для рассечения всего мозга на 4% параформальдегид в PBS. Постфиксируйте мозги на ночь при температуре 4 градуса по Цельсию. На следующий день отделите задние мозги с помощью щипцов и промойте раствором PBS.
Затем инкубируйте задний мозг в растворе йода Люголя в течение 48 часов. После инкубации кратковременно высушите задний мозг на воздухе, чтобы удалить избыток раствора йода Люголя. Затем упакуйте окрашенный йодом задний мозг Люголя в микроцентрифужные пробирки объемом 0,65 микролитра и полностью запечатайте пластиковой парафиновой пленкой, чтобы избежать усадки тканей. Поместите микроцентрифужные пробирки в пятимиллилитровые пластиковые пробирки с губками, чтобы они не двигались во время сканирования.
Вертикально установите трубку, содержащую задний мозг, на алюминиевый держатель в системе микро-КТ. Задайте параметры сканирования. Используйте 540 проекций за двухсекундное время экспозиции с условиями источника 50 киловольт и 10 ватт для получения наборов томографических данных. Рентгенограммы со сканера автоматически реконструируют его с помощью аппаратного программного обеспечения для реконструкции проекции, поставляемого системой микро-компьютерной томографии, создавая серию изображений из 16-битных осевых срезов.