Двойная флуоресцентная визуализация для идентификации дифференцированных олигодендроцитов

Возьмем культуру клеток-предшественников олигодендроцитов (OPC), выделенных из мозга детеныша крысы, которые были индуцированы к дифференцировке в олигодендроциты. Клетки фиксируются для сохранения клеточной архитектуры.

Дифференцированные олигодендроциты экспрессируют основной белок миелина, или MBP, маркер зрелых олигодендроцитов, в то время как OPC и дифференцированные клетки экспрессируют фактор транскрипции олигодендроцитов 2, или Olig2.

Применяют раствор, блокирующий пермеабилизацию, и инкубируют с перемешиванием, проникая в клеточные мембраны и блокируя неспецифические сайты связывания.

Добавьте первичные антитела, нацеленные на маркеры, и инкубируйте с перемешиванием, чтобы обеспечить связывание.

Промойте для удаления несвязанных антител, затем добавьте различные флуорофор-конъюгированные вторичные антитела, специфичные для первичных антител, и инкубируйте с перемешиванием.

Промойте клетки, затем поместите их в двойную флуоресцентную систему визуализации.

Используйте свет определенной длины волны для возбуждения различных флуорофоров и обнаруживайте излучаемые сигналы для визуализации маркеров.

Идентификация дифференцированных олигодендроцитов, экспрессирующих olig2 и MBP, среди недифференцированных OPC, экспрессирующих только olig2.

Доведите тарелку до комнатной температуры. Аспирируйте лунки и добавьте 250 микролитров DPBS, содержащих 5% NGS и 0,1% Triton X-100. Инкубируйте планшет при комнатной температуре в течение одного часа с легким встряхиванием орбиты. Готовят первичный инкубационный раствор путем разведения мышиного моноклонального анти-ММП антитела и кроличьего поликлонального анти-OLIG2 антитела в DPBS, содержащем 5% NGS. Затем инкубируйте первичные антитела при температуре 4 градуса Цельсия в течение ночи в течение 16-18 часов с легким встряхиванием орбиты.

Во время промывки планшета приготовьте вторичный инкубационный раствор, разбавив антитела против мыши 680 и против кролика 800 в DPBS, содержащем 5% NGS. Далее отсасывайте окончательную промывку и добавляйте 250 микролитров вторичного инкубационного раствора. Защитите пластину от света и выдержите ее при комнатной температуре в течение одного часа, слегка встряхивая орбиту.

После этого отсканируйте пластину с помощью системы визуализации, способной обнаруживать флуоресцентное излучение 700 и 800 нанометров. В качестве отправной точки установите смещение фокуса на 3 и чувствительность на 1,5 для MBP, 5,0 для актина и 3,5 для OLIG2. При необходимости отрегулируйте значения чувствительности, чтобы избежать передержки сигнала.