Энциклопедия экспериментов JoVE
Нейронауки
0 просмотров • 5:37 мин. • May 29th, 2025
Начните с участка эпидермальной ткани кожи, содержащего внутриэпидермальные нервные волокна или IENF, тонкие сенсорные нейронные окончания.
IENF богаты митохондриями, обеспечивающими энергию для передачи сигнала нейронов.
Ткань содержит флуоресцентно меченные IENF, митохондрии и ядра эпидермиса.
Используя инвертированный конфокальный микроскоп, последовательно регистрируйте дискретные флуоресцентные сигналы на соответствующих длинах волн для ядер, IENF и митохондрий.
Активируйте сканирование в реальном времени, чтобы зафиксировать сигнал IENF, охватывающий эпидермальный слой.
Затем выполните последовательное сканирование для каждого сигнала, чтобы устранить перекрестные помехи сигнала флуоресценции.
Из объединенного изображения с помощью программного обеспечения обрезайте и изолируйте синие флуоресцентные клетки эпидермиса.
Затем обработайте обрезанную область, чтобы улучшить разрешение зеленых сигналов IENF и красных митохондриальных сигналов.
Затем сгенерируйте 3D-изображение поверхности, чтобы создать маску для IENF, а затем наложите на изображение митохондриальной поверхности, чтобы изолировать нервно-специфические митохондрии.
В конечном итоге IENF отображаются голубым цветом, в то время как митохондрии выглядят как крошечные структуры пурпурного цвета.
Выберите 40-кратный масляный иммерсионный объектив на инвертированном лазерном сканирующем конфокальном микроскопе. Выберите подходящие лазеры и детекторы для визуализации ядер, нервных волокон и митохондрий. Введите следующие параметры сканирования в программное обеспечение микроскопа с 12-битным разрешением интенсивности. Частота развертки 600 Гц с двухкадровым усреднением и зумом 2,2. Настройте программное обеспечение микроскопа для оптимального бокового разрешения, выбрав разрешение сканирования 1024 x 1024. Оптимизируйте осевое разрешение и оптическое сечение, выбрав конфокальную апертуру одного воздушного устройства с шагом Z 210 нанометров.
Сканируйте каждый сигнал отдельно и регулируйте напряжение детектора и смещение, чтобы удалить все избыточные и недостаточно насыщенные пиксели. Активируйте сканирование нервного сигнала в реальном времени и отрегулируйте регулятор фокусировки Z, чтобы найти и установить верхнюю и нижнюю фокальные плоскости в программном обеспечении микроскопа, которые охватывают нервный сигнал в области ткани. Сканирование финальной серии z с помощью последовательного сканирования для устранения перекрестных помех флуоресцентного сигнала.
Изолируйте эпидермис от рогового слоя и дермы, нарисовав область вокруг эпидермиса с помощью инструмента выделения на дубликате исходного изображения. Затем обрежьте изображение до выделения. Вычисление функций рассеяния точки для конфокальных сигналов зеленого и красного флуоресцентных сигналов с помощью функции расчета разброса. Затем установите параметры для среднего показателя преломления для масла на 1,515 и числовую апертуру для 40-кратного масляного объектива на 1,25. Установите отверстие детектора на одну область, единицу измерения и выберите длину волны лазерного возбуждения.
Используйте итеративное восстановление, установленное на 100% достоверность, предел итерации в 10 циклов, а также зеленый и красный PSF для деконволюции зеленого и красного сигналов флуоресценции. Используйте инструмент Создать поверхность для создания поверхности вокруг деконволюционных нервных сигналов, выбрав неотмеченный плавный объект, абсолютную интенсивность для порогового значения, нижний порог 3 000 и верхний порог 65 535. Держите поверхности выше 10 вокселей.
Удалите ненервные поверхности с помощью вкладки «Правка» на нервной поверхности, чтобы выбрать одиночные ненервные поверхности, или, удерживая нажатой клавишу Control, чтобы выбрать несколько ненервных поверхностей. Удалите выбранные ненервные поверхности, нажав кнопку Delete. Используйте вкладку «Правка» на нервной поверхности и нажмите кнопку «Маскировать все» в свойствах маски.
В новом окне выберите Channel 5 Mitochondria Deconvolved под выделением Channel, а затем проверьте дубликат канала перед применением маски. Нажмите радиокнопку для постоянного внутреннего снаружи и проверьте установленное вокселя снаружи поверхности на 0,0. И нажмите кнопку OK.
Наконец, создайте специфичные для митохондрий поверхности с помощью инструмента «Создать поверхность», чтобы создать поверхность вокруг замаскированных деконволюционных митохондриальных сигналов, выбрав неотмеченный параметр «Сглаживание» и используя «Вычитание фона» для порогового значения. Установите диаметр самой большой сферы равным 1,50 микрометра, нижнего порога — 2 000, а верхнего порога — максимальному 65 535. Обязательно держите поверхности выше 1,0 вокселей.