Визуализация нейрональных митохондрий с помощью серийного сканирующего электронного микроскопа

Возьмем обрезанный, залитый смолой участок ткани мозга мыши, содержащий гиппокамп.

Этот срез окрашен тяжелыми металлами для усиления контраста под электронным микроскопом.

Установите секцию на алюминиевый штифт с помощью цианоакрилатного клея.

Смажьте боковые стороны блока коллоидной серебряной пастой, чтобы создать проводящую траекторию к алюминиевому штифту.

Осмотрите тканевый блок с помощью серийного сканирующего электронного микроскопа (SBFSEM).

В SBFSEM ультрамикротом последовательно разрезает блок на ультратонкие слои, в то время как низковольтный электронный пучок сканирует открытую поверхность.

Детектор обратного рассеяния электронов захватывает 2D-изображения с высоким разрешением, выявляя митохондрии и окружающие клеточные структуры.

С помощью соответствующего программного обеспечения отрегулируйте яркость и контрастность для повышения четкости изображения.

Выровняйте последовательные изображения, чтобы реконструировать 3D-объем ткани мозга. Эта 3D-реконструкция позволяет точно отобразить морфологию митохондрий, пространственное распределение и их отношения в нейронных компартментах.

Обрежьте образцы в интересующей области и закрепите их на алюминиевом штифте с помощью гелеобразующего цианоакрилатного суперклея. Затем покройте образец коллоидной серебряной пастой по бокам блока, чтобы обеспечить проводящий путь к алюминиевому штифту. Исследуйте образцы тканей с помощью сканирующего электронного микроскопа, оснащенного внутрикамерным ультрамикротомным столиком и детектором низкокиловольтных обратно рассеянных электронов.

Представьте образцы с этими настройками. Начните анализ с выбора типа изображения, затем выберите 8-битный для преобразования изображений в 8-битный формат TIFF из исходного проприетарного 16-битного формата. Если автоматическое преобразование контраста и/или яркости на этом этапе не является идеальным для изображений, повторно откройте 16-битные изображения и нажмите изображение. Отрегулируйте яркость, контрастность.

Выберите диапазон, который подходит для всех изображений, и нажмите Применить. Затем выполните преобразование. Если произошло недопустимое перемещение изображений между срезами, выровняйте стеки изображений, выбрав «Подключаемые модули», «Регистрация» и «Линейное выравнивание стека» с помощью SIFT, и установите выравнивание для режима «Только трансляция», а не для жесткого тела.

Увеличьте размер холста перед регистрацией, выбрав изображение, настройте размер холста. В качестве альтернативы можно уменьшить изображение до области интереса, выбрав нужную область и затем обрезав ее. При необходимости масштабируйте изображения до меньшего, более удобного размера с помощью изображения j, затем выберите изображение и масштаб.