Идентификация подтипов ганглиозных клеток сетчатки мыши с помощью флуоресцентной трассировки

Поместите ткань сетчатки, выделенную от трансгенной мыши, с флуоресцентно мечеными ганглиозными клетками сетчатки, или РГК, в записывающую камеру.

Визуальная информация передается в РГК, аксоны которых передают ее в мозг через зрительный нерв.

Подтипы РГК различаются по разветвлению дендритов, которые расслаиваются на подслои внутри внутреннего слоя сетчатки.

Расплющите ткань сетчатки и закрепите ее с помощью тканевого анкера.

Перенесите камеру на предметный столик микроскопа и перфузируйте насыщенный кислородом раствор для поддержания жизнеспособности RGC.

С помощью инфракрасного освещения определите флуоресцентные РГК.

Поместите пипетку, содержащую флуоресцентный индикатор, на RGC.

Приложите положительное давление, чтобы предотвратить засорение.

Переключитесь на отрицательное давление, втягивая мембрану в пипетку, чтобы сформировать уплотнение.

Примените всасывание, чтобы разорвать мембрану, создавая конфигурацию целых клеток, которая способствует диффузии индикаторов в дендриты.

Наблюдайте за дендритной морфологией и стратификацией для выявления подтипов RGC.

Промойте сетчатку в насыщенном кислородом внеклеточном растворе и перенесите ее в камеру со стеклянным дном с помощью пластиковой пипетки для переноса. После этого с помощью щипцов аккуратно расплющиваем ткань фоторецепторным слоем вниз. Удалите лишнюю жидкость с помощью пипетки. И закрепите ткань с помощью платинового кольца с нейлоновой сеткой. Затем заполните камеру кислородосодержащим внеклеточным раствором и установите его на предметный столик микроскопа. Перфузируйте ткань кислородосодержащим внеклеточным раствором со скоростью от 2 до 4 миллилитров в минуту.

Чтобы подготовиться к этой процедуре, вытащите несколько стеклянных микропипеток для электрофизиологической записи с помощью съемника микропипеток. Наблюдайте за слоем ганглиозных клеток с помощью ИК-ДIC оптики. Затем определите GFP плюс ганглиозные клетки с помощью эпифлуоресценции на глубине около 480 нанометров. Далее найдите пипетку, наполненную внутриклеточным раствором, в ДВС-синдроме. Приложите небольшое положительное давление и обнулите смещения напряжения на усилителе.

Затем опустите стеклянную микродозатор на ячейку с положительным результатом GFP и примените действия команды испытательного напряжения для контроля сопротивления уплотнения. Отрицательное давление должно образовывать гигаомное уплотнение между пипеткой и клеточной мембраной. После формирования стабильного уплотнения разорвите мембрану, применяя короткие импульсы отрицательного давления, чтобы получить доступ ко всей клетке. Подождите одну-две минуты, пока дендриты клетки заполнятся флуоресцентным индикатором.