Энциклопедия экспериментов JoVE
Нейронауки
0 просмотров • 3:54 мин. • May 29th, 2025
Закрепите иммобилизованную трансгенную дрозофилу с экспонированной головой в регистрирующей камере на предметном столике флуоресцентного микроскопа.
Тело гриба мухи состоит из нейронов, экспрессирующих чувствительный к кальцию биолюминесцентный гибридный белок, который активируется предварительно загруженным кофактором.
Подсоедините к камере перфузионную трубку. Найдите флуоресцентные тела грибов, сосредоточившись на чашечке и медиальных долях. Подтвердите дренаж с помощью буфера.
Установите параметры визуализации и сосредоточьтесь на чашечке и медиальных долях. В темноте получите базовые флуоресцентные изображения тел грибов до воздействия стимулятора.
Перфузия никотина в кальцийсодержащем буфере активирует никотиновые ацетилхолиновые рецепторы, вызывая приток кальция и биолюминесцентное излучение света.
Промойте буфером для восстановления исходных условий. Промывайте
хлоридом калия для деполяризации нейронов, запуская внутриклеточное высвобождение кальция и излучение биолюминесцентного сигнала.
Промойте буфером для восстановления исходных условий.
Анализируйте изображения для оценки пространственной и временной активности кальция в чашечке и медиальных долях.
- Далее поместите образец на крепление под микроскопом и отрегулируйте увеличение до 5x. Затем вставьте перфузионную трубку в канал через прокол. Установите микроскоп в режим флуоресценции, а затем по центру, и сфокусируйте грибовидные тела. Как только тела грибов окажутся в фокусе, измените увеличение на 20x. Отцентрируйте изображение по центру и отрегулируйте фокус.
Затем расположите дренажный аппарат над дренажным бассейном и отрегулируйте высоту дренажного шунта так, чтобы наконечник находился чуть выше дренажного бассейна. Затем промойте образец раствором Рингера в течение 30 секунд, чтобы проверить достаточный дренаж. Наконец, потяните щиток вниз, чтобы изолировать устройство от любого внешнего света.
С помощью автоматизированной системы в программе Photon Imager внесите тонкие корректировки в фокус, и сделайте эталонное флуоресцентное изображение тел грибов. Отрегулируйте положение прямоугольников области интереса над чашечкой, телами клеток и медиальными лепестками, щелкая по прямоугольникам и перетаскивая их в нужное положение, удерживая Control.
Теперь запишите базовые значения в течение примерно 5–10 минут. Далее нажмите на выключатель, чтобы начать поступление никотина. В то же время нажмите клавишу Enter и добавьте примечание, означающее, что поток никотина начался. Через минуту остановите поток и сделайте еще одну отметку в журнале, означающую, что поток был остановлен. Затем промойте образец раствором Рингера в течение пяти минут.
Пока образец восстанавливается, выключите промывку, установите таймер еще на пять минут и приготовьтесь к запуску потока хлорида калия. Когда все будет готово, запустите поток хлорида калия и введите 100 миллимолярных линий хлорида калия в журнал отбора проб. Через минуту остановите поток и введите отключенный хлорид калия в журнал отбора проб. Затем промойте образец раствором Рингера в течение одной минуты и переключите микроскоп в флуоресцентный режим. Сделайте окончательное флуоресцентное изображение, а затем выключите раствор Рингера и удалите образец.