Таргетная абляция нейронов с помощью двухфотонной микроскопии у рыбки данио-рерио

Начните с обезболенной трансгенной личинки данио-рерио, обездвиженной в агарозе и помещенной в чашку Петри, содержащую раствор анестетика.

Поместите его под двухфотонный лазерный микроскоп, который использует два фотона для детальной визуализации.

Сосредоточьтесь на верхних и нижних слоях мозга, чтобы установить границы визуализации.

Делайте снимки на разной глубине для наблюдения за нейронами перед лазерным лечением.

Настройте фокус на интересующей области и отрегулируйте размер кадра, чтобы уточнить фокус на нейронах.

Выберите и облучите нейроны с помощью двухфотонного лазера.

Лазер индуцирует локализованное тепло, что приводит к гибели нейронов с минимальным повреждением окружающих тканей. Сделайте снимок.

Сравните изображения до и после лечения для оценки изменений флуоресценции.

Перефокусируйте нейроны в более глубоких плоскостях и повторите облучение, чтобы обработать все нейроны в интересующей области.

Сделайте повторный захват изображения и сравните его с изображением, полученным до обработки. Потеря флуоресценции после лазерного лечения подтверждает успешную нейрональную абляцию.

Поместите внедренную в агарозу личинку под 2-фотонный лазерный сканирующий микроскоп и запустите систему микроскопии. Откройте программное обеспечение для получения изображений и на вкладке «Лазер» нажмите кнопку «Вкл.», чтобы включить лазер. Подождите, пока состояние лазера изменится с «Занято» на «Режим заблокирован».

На вкладке Channels (Каналы) установите длину волны лазера на 880 нанометров для абляции EGFP или 800 нанометров (800 нанометров) для абляции GcAMP. Выберите объектив с 20-кратным увеличением, вручную перемещая объектив револьвера. Затем перейдите на вкладку «Найти». Нажмите GFP, чтобы изменить оптические пути и непосредственно просмотреть флуоресценцию на глаз. Центрируйте мозг личинки данио-рерио в поле зрения. Затем перейдите на вкладку «Получение», чтобы вернуться к двухфотонной микроскопии, и установите мощность и усиление лазера.

В качестве записи условия перед абляцией нажмите Z-Stack, чтобы выбрать опцию Z-Stack. Затем, сосредоточившись на вентральном конце мозга личинки, нажмите кнопку «Установить первым», чтобы установить нижний предел. И после того, как вы сосредоточитесь на самой дорсальной поверхности мозга, нажмите кнопку «Установить последнюю», чтобы установить верхний предел. Наконец, нажмите кнопку «Начать эксперимент», чтобы запустить получение изображения Z-Stack.

Далее выберите объектив с 63-кратным увеличением, вручную перемещая объектив револьвера. Затем перейдите на вкладку «Найти», чтобы переключиться на эпифлуоресцентную микроскопию. Центрируйте клетки, которые должны быть удалены, с помощью глаза. Затем перейдите на вкладку «Сбор», чтобы вернуться к лазерной сканирующей микроскопии.

На вкладке Режим сбора данных установите размер кадра 256 на 256. Нажмите кнопку Live и наблюдайте за интересующими нейронами. Затем, начиная с самой дорсальной стороны, найдите фокальную плоскость, в которой клетки, подлежащие абляции, находятся в фокусе. С помощью функции «Регионы» отметьте небольшую круглую область диаметром около одной трети размера клетки на каждом нейроне в качестве ROI.

Установите скорость сканирования равной 13,93 секунды на 256 на 256 пикселей, что соответствует времени задержки лазера примерно 200 микросекунд на пиксель или 200 микросекунд на полмикрона. Также установите цикл итераций на 4 повторения. Нажмите кнопку Начать эксперимент, чтобы выполнить временные ряды и функции обесцвечивания. Сравните изображение до абляции с изображением после абляции в цикле временных рядов, чтобы убедиться, что флуоресценция в клетках-мишенях исчезла.

Далее сдвиньте фокальную плоскость немного вглубь и выберите следующую фокальную плоскость, где появляются неабляционные клетки. Выполните функцию обесцвечивания, как показано выше, и повторяйте процесс до тех пор, пока все клетки в интересующей нервной структуре не будут удалены. После абляции проверьте клетки на наличие отмененной флуоресценции и при необходимости повторите лазерное облучение.