Визуализация in vivo мозга личинок данио-рерио для визуализации нейронов мозжечка

Начните с обезболенных личинок трансгенных рыбок данио в монтажной камере, содержащей насыщенный кислородом физиологический буфер под стереомикроскопом.

Мозжечок в головном мозге содержит генетически модифицированные нейроны Пуркинье, экспрессирующие флуоресцентные цитоплазматические белки.

Удалите лишнюю среду, затем добавьте расплавленную агарозу, чтобы обездвижить личинок для стабильной визуализации.

Ориентируйте личинки спинной стороной вверх, чтобы визуализировать мозжечок.

После застывания обрежьте излишки агарозы. С помощью стеклянной иглы иссеките пигментированную кожу, покрывающую мозг, чтобы обнажить ее.

Переверните агарозный блок на камеру визуализации, содержащую расплавленную агарозу, для получения изображений под перевернутым микроскопом.

Добавьте физиологический буфер для сохранения функции нейронов.

Расположите камеру под перевернутым конфокальным микроскопом. Применяйте возбуждающий свет для возбуждения флуоресцентных белков, что позволяет визуализировать помеченные нейроны.

Пигментированные клетки кожи, если их не удалить, рассеиваются и поглощают возбуждающий свет, снижая интенсивность флуоресценции.

Удаление кожи улучшает проникновение света для повышения интенсивности флуоресценции, облегчая визуализацию нейронов.

Чтобы внедрить личинку, с помощью пастеровской пипетки перенесите обезболенную личинку в монтажную камеру под стереомикроскопом. Если какая-либо личинка все еще способна двигаться, не используйте рыбу для эксперимента до тех пор, пока рыба полностью не сможет двигаться. Когда личинка будет неподвижна, осторожно удалите лишнюю среду и сразу же добавьте на личинку не менее 1 миллилитра легкоплавкой агарозы.

Ориентируйте рыбок данио так, чтобы спинная область была обращена вверх как можно ближе к поверхности агарозы. Если личинки будут визуализироваться с помощью инвертированного микроскопа, после застывания обрежьте агарозу, содержащую личинку, в небольшой кубовидный блок. Чтобы открыть мозг для визуализации, при необходимости удалите избыток агарозы над интересующей областью мозга и с помощью стеклянной иглы сделайте небольшой разрез через кожу рядом, но не над интересующей областью, не проникая слишком глубоко в ткань.

Едва продвигая иглу прямо под поверхностью кожи, продолжайте осторожно делать очень маленькие надрезы вокруг интересующей области до тех пор, пока кожа над интересующей областью не будет удалена или отодвинута в сторону. Когда ткань будет удалена из всех эмбрионов, добавьте небольшую каплю легкоплавкой агарозы в заранее подготовленную камеру визуализации инвертированного микроскопа и с помощью небольшого шпателя переверните кубовидный агарозный блок на 180 градусов на каплю агарозы в камере визуализации. Когда агароза застынет, заполните камеру визуализации свежим ACSF и начните визуализацию личинки.