Лазерная абляция с индуктивно связанной плазмой-масс-спектрометрией для визуализации металлов в тканях мозга мыши

Поместите образец ткани мозга мыши и стандарты в камеру лазерной абляции.

Стандарты содержат известные концентрации металлов, добавленных в гомогенаты мозговой ткани ягненка.

Заполните камеру газообразным аргоном и сфокусируйте ультрафиолетовый лазерный луч на ткани.

Лазер испаряет образец и стандарты по линейной схеме, создавая аэрозоль из мельчайших частиц.

Газообразный аргон переносит частицы в индуктивно связанную плазму, источник высокотемпературной ионизации.

Плазма распыляет и ионизирует частицы в положительно заряженные ионы.

Ионы поступают в масс-спектрометр и разделяются на основе их отношения массы к заряду.

Полученные данные сравниваются со справочной базой данных для идентификации металлов, присутствующих в образце. На основе стандартов создается калибровочная кривая.

Рассчитайте концентрацию металлов в образце, откалибровав интенсивность его сигнала в соответствии со стандартами, выявив пространственное распределение металлов в срезе мозга.

Сначала поместите образец ткани мозга и все соответствующие стандарты тканей матрицы в камеру лазерной абляции. Убедитесь, что сэмплы находятся в пределах глубины резкости камеры LACCD. Закройте дверцу камеры и пальцем затяните винты.

Затем в программном обеспечении ICP-MS откройте клапан несущего газа и установите расход на 1,2 литра в минуту. В программном обеспечении LA выполните 30-минутную продувку абляционной ячейки газом-носителем для 2-объемной абляционной ячейки. Каждые 10 минут перемещайте ступень для отбора проб в каждый угол камеры, чтобы уменьшить количество остаточного воздуха в камере.

Включите ICP-MS и дайте прибору прогреться в течение двух часов. Во время нагрева инструмента в программном обеспечении для лазерной абляции проведите линию абляции длиной примерно 3 миллиметра по поверхности первого стандарта ткани. Щелкните линию абляции и установите диаметр луча по умолчанию, скорость сканирования и флюенс излучения. Продублируйте линию шесть раз, раздав линии на диаметр луча. Повторите этот процесс для каждого стандарта.

Затем с помощью инструмента «Линия» нарисуйте область абляции над образцом от верхнего левого угла до самой широкой точки образца, используя те же параметры, что и для стандартов.

Дублируйте линию по мере необходимости для полного охвата образца с тем же интервалом, который используется в стандартах. Затем нарисуйте набор линий для прерывистого сканирования эталонов не позднее, чем через 20 часов сканирования образца или между каждым образцом. Добавьте скан стандартов в конце эксперимента.

Исходя из длины линии и скорости сканирования, определите время анализа для образца и стандартных линий. Затем создайте новую партию в программном обеспечении ICP-MS и выберите «Анализ с временным разрешением». Выберите интересующие значения соотношения массы и заряда и установите время интегрирования для каждого коэффициента, чтобы общее время интегрирования для одного цикла составляло 0,25 секунды. Сохраните партию.

Для стандартной партии заполните время анализа для каждой линии дополнительным 15-секундным буфером, чтобы учесть время лазерного прогрева и промывки. Задайте образец списка прогонов с получением данных для каждой стандартной линии. Для партии образцов дублируйте стандартную партию и отрегулируйте время и количество сборов в соответствии с шаблоном абляции образца.

После того, как ICP-MS прогреется, добавьте первую партию в очередь и убедитесь, что программное обеспечение ожидает триггера от прибора LA. Затем в программном обеспечении LA включите источник питания лазера и установите время прогрева и промывки лазера. Запустите последовательность лазеров и убедитесь, что ICP-MS правильно начинает сбор данных после абляции.

После сбора данных извлеките данные для стандартов из файлов CSV. Выполните базовое вычитание и исключите фоновый сигнал. Определите падения сигнала, вызванные отверстиями в стандартах тканей.

Замаскируйте эти области с низким уровнем сигнала, а затем экспортируйте данные в виде электронной таблицы. Рассчитайте коэффициент преобразования CPS в PPM для каждого идентифицированного элемента. Повторите этот процесс для каждого стандарта.

Затем откройте программу для создания количественных изображений и импортируйте образцы данных из файлов CSV. Выделите несколько областей фона, чтобы применить коррекцию фона. Выберите инструмент редактирования графиков, щелкните правой кнопкой мыши изображение и выберите «Изменить внешний вид изображения». Измените первый цвет в точке Z на большое отрицательное значение.

И нажмите «Готово», чтобы усилить фоновый сигнал. Затем на вкладке Стандарты введите поправочные коэффициенты CPS PPM для каждого стандарта и нажмите кнопку Перейти. Откройте Обозреватель данных на вкладке «Данные», щелкните правой кнопкой мыши файл исправленного изображения и выберите «Новое изображение».

Откройте окно Изменить внешний вид изображения и установите таблицу цветов и масштаб. Используйте утилиту «Добавить аннотацию», чтобы разместить цветовую шкалу на изображении. Настройте цветовую шкалу в окне цветовой шкалы. После того, как изображение будет раскрашено и аннотировано, либо скопируйте и вставьте изображение в другую программу, либо экспортируйте изображение из программного обеспечения для создания изображений.

Чтобы активировать инструменты ROI, выберите «Обработка изображений» в пакетах «Анализ» и выберите изображение. На вкладке Изображение нажмите ROI и запустите ROI Draw. Выберите интересующий регион и нажмите кнопку Завершить ROI.

На вкладке Изображение нажмите Статистика, чтобы получить данные о ROI. Скопируйте и вставьте данные в таблицу, сохраняя их при добавлении каждого ROI. При необходимости повторите процесс.