Энциклопедия экспериментов JoVE
Нейронауки
0 просмотров • 2:40 мин. • June 17th, 2025
Начните со среза ткани мозга крысы, установленного на предметном стекле и погруженного в буфер.
Крыса страдает от тубулинопатии, состояния, вызванного дефектами тубулина, строительных блоков микротрубочек, что приводит к их аномальному накоплению и разрушению.
Это также влияет на выработку миелина в центральной нервной системе.
Поместите срез под закрытый двухфотонный микроскоп для получения подробной визуализации.
Регулярно увлажняйте ломтик, чтобы сохранить его целостность.
Переведите микроскоп в режим визуализации без сканирования, что позволяет обнаруживать слабые сигналы без использования меток.
Подвергните ткани воздействию импульсного инфракрасного лазера.
Микротрубочки излучают свет в виде обнаруживаемых сигналов, известных как сигналы второй гармоники или сигналы ГВГ.
Участки с аномальным накоплением микротрубочек усиливают эти сигналы, повышая их обнаруживаемость.
Примените оптические фильтры для уточнения этих сигналов.
Полученное изображение показывает плотность микротрубочек и аномалии, при этом высокая интенсивность ГСП и кластеризация указывают на дефекты тубулина и сниженную продукцию миелина.
Поместите образец под микроскоп и расположите его соответствующим образом под объективом путем прямого наблюдения через окуляры с проходящим светом. Удалите излишки HBSS так, чтобы тонкая жидкая пленка покрыла весь образец. Визуально проверяйте жидкую пленку каждые несколько минут, чтобы избежать чрезмерного испарения и высыхания образца.
Подготовьте предметный столик микроскопа для получения изображений без сканирования, что включает в себя закрытие всех дверей темной инкубационной камеры, или накрытие инкубационной камеры тканью с черным нейлоновым полиуретановым покрытием. Выберите режим визуализации без сканирования вдоль пути передачи. Таким образом, будет оптимизирован захват слабого сигнала SH тубулина.
Затем выберите цель. Далее установите мощность лазера с временем задержки пикселей 12,6 микросекунд. Делайте снимки размером не более 512 на 512 пикселей со скоростью 5 и средним значением 2 при среднем времени съемки 15 секунд. Сначала делайте снимки с помощью фильтра коротких частот 485 нанометров. И на втором шаге добавьте резкий 405-нанометровый полосовой фильтр.