Визуализация и количественная оценка регенерации аксонов в аксотомизированных ганглиозных нейронах сетчатки крысы

Возьмем совместную культуру иммортализованных человеческих обонятельных оболочек глии, или клеток OEG, и аксотомизированных ганглиозных нейронов сетчатки крысы, или RGN, на покровном листе.

Клетки OEG проявляют нейрорегенеративные свойства, которые способствуют регенерации аксонов в RGN.

РГН имеют иммунометку таким образом, что их сомы, или клеточные тела, флуоресцируют красным цветом, а аксоны – зеленым.

С помощью монтажного носителя закрепите покровное стекло, содержащее элементы.

Используйте эпифлуоресцентный микроскоп для получения нескольких изображений RGN.

Откройте изображение в программном обеспечении для обработки изображений.

Количественно оцените процентное соотношение нейронов с аксонами по отношению к общему числу RGN.

Затем обведите аксон, начиная от сомы до конца, и начните отслеживание аксонов, чтобы определить длину всех аксонов.

Количественно оцените индекс регенерации аксонов путем деления суммы всех длин аксонов на общее количество RGN.

Установите покровные стекла с монтажным носителем и держите их при температуре 4 градуса Цельсия. Используйте 40-кратный объектив эпифлуоресцентного микроскопа для количественной оценки регенерации аксонов. Количественно оцените процент нейронов с аксонами по отношению к общей популяции ганглиозных нейронов сетчатки.

Используйте плагин NeuronJ в ImageJ для количественной оценки индекса регенерации аксонов, или средней длины аксона, которая представляет собой сумму длин всех идентифицированных аксонов, деленную на общее количество подсчитанных нейронов, независимо от того, представляли они аксон или нет. После открытия изображения нажмите на кнопку «Анализ» и установите масштаб в соответствии с настройками микроскопа, работая в пикселях на микрометр. Выберите «Добавить трассировки», чтобы начать отслеживание аксонов, затем отслеживайте аксоны от сомы до конца. Нажмите «Измерить трассировку», отобразите измерения трассировки и «Выполнить».