Экспериментальные манипуляции размеры тела оценить морфологические Отношения масштабирование в Drosophila

Общая цель следующего эксперимента заключается в использовании манипуляций с доступностью пищи в определенные периоды развития для создания широкого диапазона размеров тела, что в дальнейшем позволит оценить аллометрическую зависимость между морфологическими признаками. Сначала в течение трех дней собирают яйца из одной и той же популяции мух, формируя три возрастные когорты. Когда личинки самой старой когорты начинают формировать куколку, личинок всех когорт удаляют из среды с пищей.

Результатом данной модификации рациона является расширение диапазона изменчивости размеров куколок. Затем для всех особей делают снимки куколок и крыльев взрослых насекомых, чтобы оценить морфологическую зависимость масштабирования между размером тела и размером крыльев. В конечном итоге, путем применения линейной регрессии второго типа к полученным данным, определяются закономерности масштабирования размера крыльев относительно всего диапазона возможных размеров тела.

В данном исследовании мы используем манипуляцию доступом к питанию в разные периоды развития для экспериментального увеличения вариативности размеров тела у взрослых мух. Это позволяет нам оценить закономерности морфологического скалирования в полном диапазоне размеров тела. Данный метод может помочь в решении ключевых вопросов, касающихся экспрессии и эволюции морфологического скалирования, например, в определении непосредственных основ вариации параметров отношений скалирования между биологическими группами.

Перенесите популяцию мух в камеру для спаривания, затем собирайте яйца каждые 24 часа в течение трех дней. В итоге, с помощью диссекционного микроскопа, сформируйте три возрастные когорты. Перенесите порции по 50 яиц из каждой когорты в пробирки, содержащие 10 миллилитров стандартной кормовой смеси для мух.

Инкубируйте флаконы при температуре, необходимой для развития личинок. Когда самая старая когорта достигнет стадии блуждания, наступает время проведения диетической манипуляции путем удаления личинок из корма. На данном этапе личинки в самой старой когорте значительно превышают минимально жизнеспособный вес для окклюзии и будут близки к естественному максимальному размеру тела.

Личинки из промежуточной когорты превысили минимальный жизнеспособный вес, однако из них разовьются более мелкие имаго, чем из личинок старейшей когорты. Личинки из самой молодой когорты находятся очень близко к минимальному жизнеспособному весу и, следовательно, дадут очень мелких имаго. Удалите личинок из корма.

Добавьте в пробирки примерно пять миллилитров 40% раствора сахарозы, затем перемешивайте в течение 15–20 минут на шейкере при средней настройке. После перемешивания извлеките всплывших личинок из раствора сахарозы с помощью тонкой кисти и поместите их по когортам в пробирки с влажной ватной пробкой для поддержания влажности. Инкубируйте при заданной температуре до момента окукливания.

Разместите куколки на предметном стекле микроскопа брюшной стороной вверх. После того как куколки будут расположены, сделайте снимки с помощью цифровой камеры, присоединенной к микроскопу. Обязательно настройте параметры так, чтобы каждая куколка выглядела как темный силуэт на белом фоне.

После получения изображений перенесите каждую куколку в отдельную пробирку типа «эппендорф» объемом 2 мл, содержащую 1 мл корма для мух. Оцените размер куколки как количество пикселей силуэта куколки. С помощью диссекционного микроскопа также могут быть использованы другие показатели размера, такие как длина или ширина.

Слегка анестезируйте муху с помощью диоксида углерода и зафиксируйте ее с помощью зажима для крыла — вакуумного устройства, которое затягивает крыло между двумя стеклами и удерживает его перпендикулярно телу мухи. Для визуализации в данном исследовании при съемке крыльев живых мух используется зажим для крыла, однако крылья и другие признаки можно выделять и снимать с помощью стандартных инструментов. Сфотографируйте крыло с помощью микроскопической камеры, подключенной к компьютеру, и отметьте пол мухи. После получения и сохранения изображения крыла оцените его размер, используя либо минимальный выпуклый многоугольник, охватывающий фиксированные краевые ориентиры (в качестве линейных измерений), либо количество пикселей силуэта крыла. Здесь представленные изображения куколок демонстрируют крайние значения распределения размеров вследствие манипуляций с рационом питания.

После того как куколка достигла минимального жизнеспособного веса для окклюзии. Также показаны соответствующие силуэты для измерения размера зрачка. Соответствующие изображения крыльев тех же особей с крайних концов распределения по размеру представлены здесь рядом с силуэтом.

Используется для оценки размера крыльев и выведения масштабирующего соотношения. Параметры, описывающие зависимость размера крыльев от размера тела, позволяют сравнить, как общая форма коррелирует с размером в разных группах. Здесь представлены данные по особям каждого пола, которые в стадии личинки были полностью накормлены, либо подвергались голоданию в течение одного или двух дней.

Хотя отдельные этапы данной процедуры выполняются быстро, в целом она может быть трудоемкой. Как правило, на обработку примерно 3 500 мух от стадии яйца до взрослого насекомого затрачивается около 350 человеко-часов. С опытом специалисты могут значительно сократить время работы с мухами; кроме того, данную процедуру можно использовать для измерения других морфологических признаков, что позволяет оценивать дополнительные закономерности морфологического масштабирования.