Энциклопедия экспериментов JoVE
Нейронауки
0 просмотров • 3:33 мин. • June 17th, 2025
Начните с оплодотворенного куриного яйца в окне, содержащего эмбрион ранней стадии, нервная трубка которого вырезана на уровне сомитов от одного до семи.
Возьмите меченую GFP донорскую нервную трубку из трансгенного куриного эмбриона, соответствующего стадии, и имплантируйте ее реципиенту, обеспечив правильную анатомическую ориентацию.
Удалите лишнюю жидкость вокруг трансплантата для улучшения адгезии между тканями донора и хозяина.
Заклейте окно прозрачным скотчем, чтобы предотвратить обезвоживание и загрязнение.
Инкубируйте яйцо до тех пор, пока зародыш не разовьется до нужной стадии.
Снимите ленту.
Определите вителлиновую вену на желтке, которая несет кровь к эмбриону, и удалите вышележащую вителлиновую оболочку.
С помощью стеклянной иглы постепенно вводите в вену липофильный флуоресцентный краситель.
Визуализируйте эмбрион под стереофлуоресцентным микроскопом.
Введенный краситель связывается с эндотелиальными клетками, выстилающими кровеносные сосуды, выделяя сосудистую сеть, в то время как меченая GFP нервная трубка позволяет отслеживать нейронную сеть.
Когда вы будете готовы начать процедуру трансплантации, осторожно перенесите рассеченную нервную трубку со стекла часов на эмбрион хозяина. Расположите нервную трубку в правильной ориентации. И аккуратно проталкиваем соседний эксплант в иссеченную область. При необходимости с помощью микроскальпеля обрезайте эксплант до точного размера иссеченной области.
Оказавшись в правильном положении, удалите PBS и другую жидкость, чтобы помочь тканям донора и хозяина прилипнуть и закрепить трансплантат. Успешная интеграция привитой GFP-положительной нервной трубки в курицу-хозяина дикого типа может быть оценена под флуоресцентным микроскопом. Заклейте все окно прозрачной лентой шириной 24 миллиметра, чтобы предотвратить обезвоживание и загрязнение.
Пометьте химерный эмбрион. И вернуть яйцо в инкубатор для дальнейшего развития.
В нужный момент времени эксперимента извлеките яйцо из инкубатора. И снимите прозрачную ленту, чтобы получить доступ к эмбриону. Как только это станет заметным, найдите доступную вену на желтке, убедившись, что кровоток направлен к эмбриону.
Выберите точку разветвления на одной из вителлиновых вен для места инъекции. С помощью пинцета удалите мембрану вителлина выше выбранной точки инъекции путем разрыва в противоположных направлениях. Далее отрегулируйте диаметр вытянутой стеклянной иглы по размеру жилки.
Загрузите в иглу от 5 до 10 микролитров раствора DiI. Быстро введите иглу в вену. И равномерно подуйте с помощью ротовой трубки, чтобы позволить DiI медленно присоединиться к кровотоку, не образуя сгустка. Успех инъекции DiI можно оценить, кратко рассмотрев эмбрион под флуоресцентным микроскопом.