$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Возьмем чашку для визуализации со стеклянным дном, содержащую эмбриональные корковые нейроны мыши.
Поместите чашку в климатическую камеру дифференциально-интерференционного контраста (DIC) микроскопа для поддержания жизнеспособности клеток во время визуализации.
Микроскопия DIC разделяет поляризованный свет на два луча, которые проходят через образец.
Изменения показателя преломления на образце приводят к фазовым сдвигам между этими пучками.
Когда пучки рекомбинируют, их интерференция создает высококонтрастное изображение, делая видимыми более тонкие ячеистые структуры.
Идентифицируйте нейроны с неразветвленными аксонами и используйте покадровую съемку для визуализации разветвления аксонов.
Лечите нетрином-1, внеклеточным направляющим сигналом, который связывается с аксональными рецепторами и запускает локализованный экзоцитоз.
Экзоцитарные везикулы доставляют компоненты мембраны к участкам, в то время как цитоскелет реорганизуется для поддержки расширения мембраны.
Под микроскопом эти изменения проявляются в виде небольших выступов, отмечающих начало разветвления аксонов.
Со временем эти выступы перерастают в зрелые аксональные ветви, иллюстрирующие динамический процесс развития нейронов.
Через два дня in vitro поместите стеклянную дно, содержащую нетрансфицированные нейроны, в предварительно нагретую влажную камеру окружающей среды. Используйте микроскоп, оснащенный 60-кратным апохроматом плана, объективом 1,4 NA, объективом DIC и конденсатором с высокой числовой апертурой для достижения наилучшего качества изображения и разрешения. Затем с помощью проходящего света отрегулируйте фокальную плоскость, чтобы найти нейроны через окуляры.
Для получения изображений разветвления аксонов с помощью DIC правильная настройка подсветки холодника будет иметь решающее значение для оптимизации изображения и имеет решающее значение для получения анализируемых результатов. Затем, когда интересующие вас нейроны находятся в поле зрения, используйте функцию сбора данных из нескольких областей в программном обеспечении для визуализации, чтобы найти и сохранить местоположения XYZ, по крайней мере, шести клеток. Теперь добавьте к конечной концентрации 250 нанограмм на миллилитр нетрина-1 или другой фактор, представляющий интерес для стимуляции клеток, и нажмите кнопку «Начать многозонное получение».
Последовательно получайте изображения в каждом положении каждые 20 секунд в течение 24 часов, приостанавливая съемку и перефокусируясь по мере необходимости. В программном обеспечении для обработки изображений просмотрите изображения, выбрав «Приложение», «Просмотреть многомерные данные», и откройте нужный файл. Определите стабильные ветви аксонов, которые формируются во время сеанса визуализации. Используйте инструмент Область трассировки для измерения устойчивой ветви аксона от основания аксона до кончика.