Визуализация быстрых кальциевых транзиентов в нервных окончаниях мышей с помощью конфокальной микроскопии

Начните с экспериментальной камеры, покрытой силиконовым эластомером, содержащей защищенную мышцу мыши, расположенную под конфокальным микроскопом.

Мышца погружается в физиологический раствор, содержащий ингибиторы, блокирующие мышечные сокращения.

Культя нерва, помеченная флуоресцентным кальциевым красителем, располагается внутри всасывающего электрода, который подключен к электрическому стимулятору.

В нервно-мышечном соединении периферический нерв соединяется с мышцей.

Подайте электрический раздражитель на нерв с помощью электрода. Это вызывает быстрый приток ионов кальция, которые связываются с внутриклеточным кальциевым красителем.

Осветите нервно-мышечное соединение, чтобы возбудить кальциевый краситель, заставляя его флуоресцировать.

Затем сделайте снимки с высоким разрешением, чтобы зафиксировать быстрые переходные процессы кальция в периферических нервных окончаниях.

Выберите интересующую область и измерьте интенсивность флуоресценции.

Быстрое увеличение интенсивности флуоресценции указывает на приток кальция в периферические нервные окончания, в то время как уменьшение отражает клиренс кальция.

Заполните перфузионную систему раствором Рингера, содержащим 10 микромолярных D-тубокураринов, и включите перфузионный аспиратор, чтобы начать перфузию. В программном обеспечении лазерного сканирующего конфокального микроскопа (LSCM) выберите электрофизиологию и режим сбора данных для настройки параметров изображения. В настройках меню Задание выберите Настройки триггера для запуска стимулятора с помощью синхроимпульса микроскопа и установите поле Триггер по выходу кадра в канал OUT 1.

Переключите режим сканирования на xyt с частотой сканирования 1 400 Гц. Коэффициент зума должен быть равен 6,1 при полностью открытом точечном отверстии. Убедитесь, что последовательный сквозной двунаправленный режим x включен. Затем установите минимальное время формирования кадра в 52 миллисекунды и соберите кадры в необработанное видео в 20 кадров. Установите длину волны возбуждения аргонового лазера на 488 нанометров с 8% выходной мощности.

Когда параметры установлены, нажмите кнопку Live Mode, чтобы получить предварительный просмотр нервных окончаний, загруженных красителем, в реальном времени. В режиме реального времени найдите область интереса, или ROI, чтобы получить наилучший фокус, затем сдвиньте задержку на стимуляторе на 2 миллисекунды меньше относительно предыдущего значения. И запустите программное обеспечение для сбора данных, чтобы получить 26 последовательностей, сдвинув каждую последовательность на две миллисекунды от предыдущей.