Тератомы поколения в капсулу яичка
7 ноября 2011 г.
Человека плюрипотентных стволовых клеток (hPSCs) обладают потенциалом для лечения множества различных заболеваний. Полезность этих клеток заключается в том, что они могут дифференцироваться в любой тип клеток в организме. Здесь мы описываем тератома анализа, которые используются для демонстрации pluripotence из hPSCs.
Общая цель данной процедуры заключается в анализе плюрипотентности путем формирования тератом в капсуле семенника иммунодефицитных мышей с использованием плюрипотентных стволовых клеток человека или H PSCs. Начните со сбора культуры предполагаемых H PSCs, которые будут протестированы на плюрипотентность. Затем проведите хирургическую операцию для обнажения семенников мыши и введите клетки в капсулу семенника.
Верните семенники на их исходное место и хирургически зашейте разрез на спине мыши. Через шесть-12 недель исследуйте полученную опухоль гистологически на наличие клеток каждого зародышевого листка. В конечном итоге результаты могут доказать, что линия HPSC действительно плюрипотентна, продемонстрировав её способность дифференцироваться в клетки всех трех зародышевых листков у иммунодефицитной мыши. Хотя в последнее время были описаны новые методы подтверждения плюрипотентности стволовых клеток человека, анализ тератомы остается золотым стандартом в данной области; процедуру продемонстрирует Трон, старший техник в моей лаборатории Culture.
Культивируйте человеческие плюрипотентные стволовые клетки до достижения конфлюэнтности, затем диссоциируйте HPSEs с помощью Accutane. Проведите подсчет клеток, чтобы подготовить суспензию из 1 миллиона HPSEs на одну инъекцию. Сначала сбрейте шерсть на животе у шестинедельных самцов мышей иммунодефицитной линии, находящихся под воздействием анестезии, используя машинку для стрижки. Очистите переднюю стенку брюшной полости мыши раствором повидон-йода, двигаясь от центра живота по часовой стрелке к периферии.
Затем промойте выбритую область 70% ethanol. Повторите эту процедуру трижды, каждый раз используя новый тампон. Для выполнения хирургической операции перенесите животное на грелку внутри стерильного бокса, используя стерильные хирургические ножницы.
Удерживая брюшину пинцетом, сделайте продольный разрез кожи и брюшины длиной один сантиметр чуть ниже уровня тазобедренного сустава. С помощью другого стерильного пинцета доберитесь до правого бедра и извлеките белую жировую ткань вместе с прикрепленными семенниками. Теперь наполните туберкулиновый шприц объемом 1 CC hpsc, предназначенными для инъекции. Медленно введите от 20 до 30 µL H PSCs в центр капсулы семенника, подальше от крупных кровеносных сосудов.
Медленно извлеките иглу с помощью пинцета, чтобы избежать рефлюкса клеток. Переместите семенники и жировую ткань обратно в исходное положение в брюшной полости. Зашейте брюшину двумя или тремя рассасывающимися швами, а кожу закройте автоклипсами.
После операции при необходимости дважды в день вводите анальгетики. В течение шести-12 недель наблюдайте за животным для выявления пальпаторного роста опухоли. При достижении размером опухоли примерно five millimeter удалите опухоль из эвтаназированной мыши для документирования.
Сфотографируйте опухоль, измерьте ее размер и вес. Затем разрежьте опухоль на мелкие фрагменты и зафиксируйте в 4% растворе паральдегида для гистопатологического исследования. Как правило, тератома наблюдается через 6–12 недель.
В данном примере 1 миллион человеческих плюрипотентных стволовых клеток WA 09 были введены в капсулу семенника иммунодефицитной мыши. При детальном изучении тератомы выявляется гетерогенность и множество прикрепленных кист, что соответствует ожиданиям.
Гистопатологический анализ указывает на наличие клеток каждого из трех зародышевых листков. При выполнении данной процедуры важно не забыть включить линию клеток положительного контроля с известным высоким потенциалом, чтобы убедиться в правильности проведения анализа. После просмотра этого видео у вас должно сложиться четкое представление о том, как определить, является ли линия стволовых клеток человека плюрипотентной.
Обзор
В данной статье рассматривается анализ тератомы — метод, используемый для оценки плюрипотентности человеческих плюрипотентных стволовых клеток (hPSCs). Метод заключается в инъекции hPSCs в капсулу семенника иммунодефицитных мышей с последующим исследованием образовавшихся тератом на предмет дифференцировки в различные типы клеток.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Биология стволовых клеток
- Регенеративная медицина
- Гистопатология
Теоретические основы
- Человеческие плюрипотентные стволовые клетки могут дифференцироваться в любой тип клеток.
- Формирование тератомы является ключевым показателем плюрипотентности.
- Данный анализ считается золотым стандартом подтверждения плюрипотентности.
- Существуют новые методы, однако анализ на формирование тератомы по-прежнему широко применяется.
Цель исследования
- Продемонстрировать плюрипотентность чПСК посредством формирования тератомы.
- Представить подробную методику проведения анализа на образование тератомы.
- Подчеркнуть важность использования положительного контроля в данном анализе.
Используемые методы
- Сбор hPSCs и подготовка к инъекции.
- Хирургическое обнажение семенника мыши и инъекция hPSCs.
- Мониторинг роста опухоли в течение шести-двенадцати недель.
- Гистологический анализ тератомы для определения дифференцировки зародышевых листков.
Основные результаты
- Тератомы сформировались через шесть-двенадцать недель после инъекции.
- Гистопатологический анализ подтвердил наличие клеток всех трех зародышевых листков.
- Продемонстрирована эффективность анализа на тератомы при оценке плюрипотентности.
- Включен положительный контроль для подтверждения результатов анализа.
Выводы
- Анализ на тератому является надежным методом подтверждения плюрипотентности чПСК.
- Правильные хирургические методы и мониторинг имеют решающее значение для успешного результата.
- В будущих исследованиях могут быть изучены альтернативные методы наряду с традиционными анализами.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Тератома-тест обеспечивает функциональную оценку плюрипотентности, демонстрируя способность к дифференцировке во все три зародышевых листка in vivo. Данный анализ способствует валидации мишеней и снижению механистических рисков на ранних этапах разработки терапевтических средств на основе стволовых клеток. Он позволяет с высокой степенью уверенности подтвердить клеточную идентичность перед переходом к доклиническим моделям.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: подтверждение плюрипотентности путем проверки дифференцировки в линии эктодермы, мезодермы и энтодермы.
- Практическая ценность: использование стандартизированной модели in vivo для снижения количества ложноположительных утверждений о плюрипотентности.
- Стратегическая ценность: возможность принятия решений о пригодности линий стволовых клеток для терапевтической разработки.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет получать количественные гистопатологические данные о представленности зародышевых листков.
- Практическая ценность: устанавливает воспроизводимый протокол инъекции в капсулу семенника иммунодефицитных мышей.
- Стратегическая ценность: способствует стандартизации анализа между лабораториями для обеспечения согласованности тестов на плюрипотентность.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Подтверждение потенциала развития hPSCs перед их дифференцировкой в линийно-специфические клетки-предшественники.
- Операционная ценность: Требуется мониторинг в течение 6–12 недель для выявления образования опухолей и проведения гистопатологического анализа.
- Стратегическая ценность: Обеспечение обоснованного с учетом рисков продвижения линий стволовых клеток к доклиническим исследованиям эффективности.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Тератома-тест служит контрольным этапом в процессе исследования стволовых клеток, который проводится после подтверждения поддержания плюрипотентности и перед направленной дифференцировкой или доклиническими испытаниями эффективности.
- Фундаментальная биология: Проверка основной гипотезы плюрипотентности путем оценки способности к дифференцировке в три зародышевых листка.
- Скрининг: Получение стандартизированных показателей частоты образования тератом и результатов гистологической оценки для сравнительного анализа клеточных линий.
- Аналитика: Получение специфических для зародышевых листков данных с помощью гистопатологии для количественной оценки потенциала дифференцировки.
- Трансляционные исследования: Связующее звено между подтверждением плюрипотентности и последующими рабочими процессами дифференцировки для получения клеток, релевантных для изучения заболеваний.
- Корпоративное использование: Служит многократно используемой контрольной точкой проверки плюрипотентности для нескольких линий hPSC при скрининге терапевтических разработок.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Снижает механистическую неопределенность в определении идентичности стволовых клеток путем подтверждения функциональной плюрипотентности.
- Операционная ценность: Обеспечивает стандартизированные, воспроизводимые результаты за счет четко определенных хирургических и гистологических процедур.
- Стратегическая ценность: Повышает эффективность использования капитала за счет раннего исключения неплюрипотентных линий в процессе разработки.
- Влияние на портфель: Позволяет осуществлять приоритезацию линий стволовых клеток на основе оценки рисков для инвестирования в дифференцировку и моделирование заболеваний.
Особенности реализации
- Требуется опыт проведения хирургических операций на грызунах и соблюдение стерильности при инъекции в капсулу семенника.
- Зависит от наличия доступа к иммунокомпрометированным линиям мышей и оборудованных помещений для послеоперационного мониторинга.
- Необходима инфраструктура для гистопатологического анализа с целью идентификации зародышевых листков в срезах тератомы.
- Требуется этический контроль и одобрение IACUC для использования животных в анализах на туморогенность.
- Ограничено временным интервалом 6–12 недель, что может замедлить проведение итерационных кампаний по скринингу.
