PDMS изготовление устройств и модификации поверхности

Меня зовут Кен Котц. Я занимаю должность постдока в Центре ресурсов Bio MAs, аффилированном с Массачусетской общей больницей. Мой основной исследовательский проект связан с выделением нейтрофилов с помощью устройства иммуноаффинного захвата с микрофлюидными структурами.

Мы используем это устройство в пяти различных больницах по всей стране для выделения РНК с целью последующего геномного анализа. По сути, перед вами мастер-матрица из фоторезиста SU8 на кремниевой подложке. Мы зальем двухкомпонентный эластомер PDMS поверх этой матрицы, и PDMS сформирует форму.

Мы извлекаем основную форму из футляра и помещаем ее в чашку Петри. Форма закрепляется лентой на дне чашки Петри. На весах мы отмеряем смесь PDMS, отвердителя и базовой смолы.

Соотношение составляет одна часть отвердителя к 10 частям смолы. Обычно для наших вырезанных устройств мы отвешиваем от 20 до 30 г смолы и соответственно от двух до трех г отвердителя. После того как отвердитель и смола будут перелиты в небольшую лабораторную лодочку, мы перемешиваем их с помощью стандартной пластиковой вилки.

Необходимо тщательно перемешивать смесь, складывая ее слоями, чтобы обеспечить равномерное распределение отвердителя в смоле. Как правило, мы контролируем качество смешивания по количеству пузырьков воздуха, стремясь добиться их равномерного распределения в виде мелких пузырьков по всему объему эластомера.

Затем мы выливаем PDMS поверх матрицы из SU-8, находящейся в чашке Петри. Матрицу с нанесенным на нее PDMS помещают в вакуумный колокол, после чего из камеры откачивают воздух, чтобы удалить пузырьки, образовавшиеся при смешивании. Как правило, процесс дегазации занимает от 30 минут до одного часа.

После дегазации мы извлекаем устройства из вакуумной камеры и помещаем их в печь при температуре от 65 до 80 °C. Минимальное время отверждения при таких температурах составляет от трех до шести часов. В нашей лаборатории мы обычно оставляем устройства в печи на ночь.

Обычно мы используем хирургический стальной скальпель № 11. Мы делаем прямые разрезы на глубину около половины сантиметра от края силиконовой матрицы, обрезая её по периметру, чтобы получить большой диск. Мы отделяем форму из PDMS от матрицы и помещаем её стороной со структурами вверх в чистую чашку Петри.

Мы извлекаем освобожденную форму из чашки Петри и помещаем ее на режущую поверхность, используя нож или нож, установленный на линейную направляющую. Мы разрезаем устройства, находящиеся на форме. Затем каждое отдельное устройство помещают обратно в чашку Петри для дальнейшей обработки.

Как правило, для сопряжения наших устройств с потоками жидкостей в устройстве из PDMS пробивают отверстия. Для этого используется стандартный шприц объемом 3 мл. На конце шприца объемом 3 мл находится стальная игла с тупым концом.

Внутри иглы из нержавеющей стали находится проволока, соответствующая внутреннему диаметру иглы. Эта проволока прикреплена к поршню шприца. Оттягивая поршень назад и извлекая иглу, можно пробить отверстие или вырезать пробку в PDMS. Переверните устройство из PDMS и извлеките его, нажав на поршень.

Секрет работы с пробойниками заключается в том, чтобы держать поршень максимально вертикально и вообще не вращать устройство. При прокалывании PDMS необходимо с помощью пинцета приподнять всё устройство целиком вместе с PDMS, перевернуть его и выдавить пробку, нажав на поршень. Затем захватите пробку пинцетом и утилизируйте её.

Затем снова отведите плунжер назад, переверните устройство и извлеките просекатель. Повторяйте эти действия до тех пор, пока не будут пробиты все необходимые отверстия. Что касается процесса склейки, мы прикрепляем наши устройства из PDMS к предметным стеклам.

Для подготовки наших устройств мы выполним необратимое соединение или ковалентное прикрепление PDMS к стеклянным предметным стеклам. Это достигается путем помещения образцов в плазменный резак (плазменный ашер) и их воздействия реактивной кислородной плазмой. Таким образом, первым шагом данной процедуры является помещение устройства из PDMS на лоток плазменного резака.

Разместив устройство элементами управления вверх, вы можете использовать любой стандартный предметное стекло для микроскопа. Для нашего устройства мы используем слегка увеличенное предметное стекло длиной в полтора дюйма. Их можно использовать сразу после извлечения из упаковки.

Мы рекомендуем обрабатывать их раствором Пиранья. Это позволяет удалить любые органические загрязнения, которые могут находиться на поверхности предметного стекла. После размещения устройства и предметного стекла на лотке для плазменного печи (асшера), вставьте лоток в установку и подвергните образцы воздействию реактивной кислородной плазмы.

После завершения программы работы плазменного очистителя (Asher) мы открываем камеру и переносим пластину с устройствами на рабочий стол. С помощью пинцета мы осторожно поднимаем устройство из PDMS, стараясь не касаться пальцами склеиваемых поверхностей. Мы переворачиваем устройство стороной для склеивания на предметное стекло, после чего убеждаемся в отсутствии пузырьков воздуха между PDMS и предметным стеклом.

Теперь мы помещаем устройство из PDMS, прикрепленное к стеклу, на нагревательную плитку при температуре от 65 до 75 °C на 10 минут для достижения более прочной химической связи. Таким образом, в данном разделе мы будем химически модифицировать поверхности PDMS и стекла; после прикрепления в чистом помещении мы получаем поверхность PDMS, содержащую реакционноспособные OH-группы. Нам необходима эта реакционноспособная поверхность, которая является гидрофильной и со временем будет диффундировать вглубь объема PDMS.

Поскольку модификацию химии поверхности лучше всего проводить сразу после плазменной обработки, мы будем использовать 5% раствор (3-меркаптопропил)триметоксисилана. Это 5% раствор по объему; мы вводим его через входное отверстие, следя за тем, чтобы устройство было заполнено полностью и без пузырьков воздуха.

Если присутствуют пузырьки воздуха, удалите их с помощью пинцета. После инъекции slan оставьте образец на 15–30 минут при комнатной температуре. Обычно через 10 минут после начала реакции вводят вторую порцию slan.

После того как реакция силила протекала примерно полчаса, мы промоем все устройства тремя-четырьмя объемами чистого этанола. Излишки вытекающей жидкости следует удалить с помощью безворсовой салфетки (chem wipe). После промывки устройств мы переносим их на нагревательную плитку, установленную на 100 °C, чтобы этанол полностью испарился. Это способствует дегидратации силилированной поверхности.

После высыхания устройство можно хранить в эксикаторе в течение нескольких месяцев или же сразу приступить к следующему этапу. После отверждения устройств на поверхностях стекла и PDMS образуется слой силана. Используемый силан представляет собой каптосилан с тиольной группой, который будет взаимодействовать с нашим гетеробифункциональным кросслинкером — GMBS.

Раствор разбавляют в чистом этаноле. Вещество реагирует с водой, поэтому следует избегать его контакта с водными средами. Мы вводим его в устройства и удаляем пузырьки воздуха пинцетом, как показано здесь, чтобы обеспечить полное покрытие всех поверхностей этой молекулой.

Мы накрываем устройство и оставляем его для протекания реакции на полчаса. После того как GMBS отреагирует в течение получаса, мы промоем устройства деионизированной водой, чтобы удалить любые следы этанола. Затем мы пропустим раствор нейтравидина, который представляет собой биотин-связывающий белок.

Затем нейтравиан предварительно разводят до концентрации 10 µg/ml. Если в устройство случайно попадет воздух, его потребуется повторно промыть этанолом для эффективного удаления всех пузырьков; этанол лучше смачивает поверхности устройства, что позволяет удалить любой случайно введенный воздух. После промывки устройств деионизированной водой мы обычно заполняем устройство diluted neutral evidence T travain раствором в объеме от двух до четырех рабочих объемов устройства.

Натт-траваин будет взаимодействовать с GMBS, который иммобилизован на поверхности любым первичным способом по отношению к натт-траваину. Этот процесс может протекать при комнатной температуре в течение одного часа. Как правило, я помещаю устройства в холодильную камеру при температуре 4 °C на ночь.

Однако перед добавлением антитела необходимо вымыть весь несвязанный в растворе Aden. Для этого мы пропускаем через систему 1% раствор BSA, разведенный в PBS. Поскольку эти чипы будут использоваться для последующего геномного анализа, все применяемые растворы должны быть свободны от РНК.

Обычно мы промываем устройство четырьмя-пятью объемами 1% раствора BSA. После этого мы добавляем антитела. В данном эксперименте используются антитела к CD 66 B и антитела, специфичные к гранулоцитам в цельной крови.

Мы используем концентрацию от 10 до 25 µg/ml и вводим антитела. В каждое устройство вводится 200 µL антител. Мы выполняем две инъекции по 100 µL, по одной в каждый порт устройства.

Обычно мы вводим 100 µL в один порт, выдерживаем паузу в 30 минут, а затем вводим еще 100 µL в противоположный порт.